筛选和表征具有相分离能力蛋白的方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种筛选和表征具有相分离能力蛋白的方法。
背景技术：
：液态-液态相分离现象广泛存在于各类无机材料中，如油与水混合形成的“油包水”或“水包油”的相分离体系。在组成有机生命的单元——细胞内，也同样存在相分离形成的生物分子凝聚体，即无膜细胞器，如rna颗粒、核仁、卡哈尔小体、dna损伤修复颗粒、中心体等1。这些无膜细胞器大多为没有膜包被，但却具有明确相界面，并且与外界存在物质交换、具有态性质的结构，在体内这类结构参与转录、翻译的调控2，dna损伤修复3，介导细胞骨架的形成4、染色质重塑5等多种重要生命过程，与有膜细胞器共同调控细胞生命活动。研究表明，蛋白驱动的液态-液态相分离是无膜细胞器形成的结构基础，越来越多的相分离蛋白被发现，这些相分离蛋白广泛参与无膜细胞结构的形成及其功能的执行，因此，筛选与鉴定新的相分离蛋白对于研究细胞如何在时间和空间尺度上组织生命活动具有重要意义。但是目前，仍有很多潜在的相分离蛋白没有被发现，一方面，成百上千的生物大分子参与无膜细胞器的形成6,7，这些组分有哪些能够驱动相分离以及执行什么样的功能值得研究；另一方面，无膜细胞器广泛存在于不同物种以及不同类型的细胞，所以驱动其形成相分离蛋白同样广泛存在于不同的物种与细胞，鉴定与研究这些相分离蛋白对于理解相分离发生的原子分子机制，以及相分离在细胞中的功能具有重要意义。然而，目前世界上还没有系统筛选和发现蛋白相分离的方法，这极大的阻碍了对于具有潜在重要生物学功能的相分离蛋白的发现和系统表征。因此，本领域迫切需要开发一套鉴定和筛选相分离蛋白的方法。技术实现要素：本发明的目的就是提供一种筛选和表征具有相分离能力蛋白的方法。在本发明的第一方面，提供了高通量筛选蛋白相分离试剂盒，设计并完成高通量筛选与鉴定潜在相分离蛋白的方法，另一方面该体系可以用以鉴定影响蛋白相分离的内在和外在因素(内在如蛋白的氨基酸序列和组成，结构的复杂度；外在如不同的buffer环境ph，peg等，或不同的mrna、药物小分子等)。在本发明中，本发明第一方面提供了一种高通量表征蛋白质相分离的方法，所述方法包括以下步骤：(a)表达纯化目的蛋白；(b)控制m个变量，制备第1-第n筛选试剂，并分别将步骤(a)的蛋白与所述的第1-第n筛选试剂混合，从而获得第1-第n混合溶液；和(c)用显微镜扫描步骤(b)的第1-第n混合溶液，对其中蛋白凝聚现象进行观察并打分；其中，n为正整数，且所述的m个变量包括涉及选自下组因素的变量：缓冲溶液、盐、高聚物、正电荷试剂、负电荷试剂、生物试剂、表面活性剂、蛋白结合剂(例如mrna或小分子药物)。在另一优选例中，所述m个变量包括涉及选自下组因素的变量：盐、高聚物、正电荷试剂、负电荷试剂、生物试剂。在另一优选例中，所述方法还包括：(c’)用酶标仪扫描步骤(b)的第1-第n混合溶液，测定400nm波长下的od吸收值。在另一优选例中，所述步骤(b)在96条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(b)在384条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(c)在96条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(c’)在384条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(b)在96条件下进行时，步骤(c)在96条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(b)在384条件下进行时，步骤(c’)在384条件下进行。在另一优选例中，所述目的蛋白选自下组：fus-lc、hnrnpa1、fus-rgg、ddx21-ntd、rbgd2、tau40、iapp、hsp27、或其组合。在另一优选例中，当所述步骤(c)在96条件下进行时，n为1-96，较佳地，25-96，更佳地，25-60，更佳地，25-36。在另一优选例中，当所述步骤(c)在384条件下进行时，n为1-384，较佳地，1-288，更佳地，25-180，更佳地，25-72。在另一优选例中，m为1-8，较佳地，2-6。在另一优选例中，所述的控制变量包括：控制对应组分在所述的筛选试剂中存在或不存在。在另一优选例中，所述的控制变量包括：控制对应试剂在所述的筛选试剂中的水平(浓度或ph值高低)。在另一优选例中，所述的缓冲溶液选自下组：bis-tris、citricacid、hepes、tris、或其组合。在另一优选例中，所述的缓冲溶液浓度为0.01mm-1m，较佳地，0.02mm-0.5m，更佳地，0.025mm-0.1m。在另一优选例中，所述的盐选自下组：zn(ac)2、ca(ac)2、mg(ac)2、mgso4、mncl2、mnso4、nacl、kac、naac、(nh4)2so4、licl、nh4cl、mgcl2、或其组合。在另一优选例中，所述的盐的浓度为0.05-3m，较佳地，0.05-0.5m，更佳地，0.05-0.3m。在另一优选例中，所述的高聚物选自下组：dextran10、dextran40、dextran70、ficoll400、peg3350、peg500、peg8000、或其组合。在另一优选例中，所述的高聚物的浓度为10％-60％w/v，较佳地，10％-40％w/v，更佳地，10％-30％w/v。在另一优选例中，所述的生物试剂选自下组：cr20、cr7、heparin、polyu、或其组合。在另一优选例中，所述的生物试剂的浓度为1μm－1000μm，较佳地，100μm-1000μm，较佳地，200μm－1000μm，更佳地，500μm-1000μm。在另一优选例中，所述的筛选试剂的ph值为3.5-8.5，较佳地，5.5-8.5，更佳地，5.5-7.5。在另一优选例中，所述的第1-第n筛选试剂为如图6或图7中所述的试剂。在另一优选例中，所述的打分包括按照下列标准给予各个混合溶液-1分至3分的打分：在另一优选例中，所述的打分包括按所测得的od值进行分类并用不同的颜色加以区分：od值(x)颜色x≥1棕红0.8＜x≤1红色0.6＜x≤0.8浅红0.4＜x≤0.6淡粉0.2＜x≤0.4蓝x≤0.2浅蓝。在另一优选例中，所述的目测浊度以图1为界。在另一优选例中，所述的方法还包括：根据所述的打分结果，绘制r热图。在另一优选例中，根据所述的打分结果，得到各个混合溶液的打分之和tp。在另一优选例中，当tp＞0时，判断该蛋白具有相分离能力。在另一优选例中，当tp＞n时，判断该蛋白具有强相分离能力，n为12－45在另一优选例中，所述方法还包括：对各个混合溶液按照影响因素种类进行分组，并根据所述的打分结果，计算每组变量下各个样品的得分平均值tp1、tp2、……、tpm，并计算各个样品的得分平均值之和tp。在另一优选例中，当tp＞0时，判断该蛋白具有相分离能力。在另一优选例中，当tp＞m时，判断该蛋白具有强相分离能力，m为12－45。在另一优选例中，所述的影响因素种类包括：缓冲溶液种类、盐种类、正电荷试剂存在与否、负电荷试剂存在与否、生物试剂存在与否、表面活性剂存在与否。本发明第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：(a)第一容器，以及位于第一容器内的目的蛋白；(b)第二容器，以及位于第二容器内的筛选试剂，筛选试剂为在合适的条件下，通过控制m个变量所获得的第1-第n筛选试剂，其中，n为正整数，且所述的m个变量包括涉及选自下组因素的变量：缓冲溶液、盐、高聚物、正电荷试剂、负电荷试剂、生物试剂、表面活性剂、蛋白结合剂(例如mrna或小分子药物)；(c)标签或说明书。在另一优选例中，所述m个变量包括涉及选自下组因素的变量：盐、高聚物、正电荷试剂、负电荷试剂、生物试剂。在另一优选例中，m为1-8，较佳地，2-6。在另一优选例中，所述目的蛋白选自下组：fus-lc、hnrnpa1、fus-rgg、ddx21-ntd、rbgd2、tau40、iapp、hsp27、或其组合。在另一优选例中，所述目的蛋白选自下组：fus-lc、hnrnpa1、fus-rgg、hsp27、或其组合。在另一优选例中，在96条件下，n为1-96，较佳地，25-96，更佳地，25-60，更佳地，25-36。在另一优选例中，在384条件下，n为1-384，较佳地，1-288，更佳地，25-180，更佳地，25-72。在另一优选例中，所述的第1-第n筛选试剂为如图6或图7中所述的试剂。在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器是同一容器或不同容器。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了打分规则。a-0分；b--1分；c-1分；d-2分；e-3分。图2显示了200μmfus(1-214aa)的最终热图。图3显示了96个条件分为15类，其每一类的颜色。图4显示了50μma蛋白的最终热图。图5显示了50μmamut蛋白的最终热图。图6显示了实施例1中各个通道的筛选试剂列表。图7显示了384筛选试剂列表。图8显示了25umfus(1-214aa)在384筛选条件下的最终结果。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种鉴定和筛选相分离蛋白的方法。基于该方法，不仅能够快速高效的鉴定已知和未知具有行重要生物学功能的蛋白是否可以发生相分离，而且可以定性的判断不同蛋白在各种条件下的相分离能力，适用于快速鉴定影响蛋白相分离的因素，研究蛋白发生相分离可能的分子原子机制。在此基础上完成了本发明。384条件在本发明中，384筛选条件分为六大类，第一类条件主要是通过ph梯度以及不同的拥挤试剂大分子对样品进行筛选，第二类条件是利用了梯度ph以及高浓度盐环境进行筛选，第三类条件设计了两种不同长度带有正电荷的氨基酸的多肽进行筛选，第四类条件通过不同种类带有负电荷环境的试剂对样品进行筛选，第五类以及第六类条件分别是利用梯度浓度的二价和单价盐对样品进行筛选，上述条件的选择基于相分离领域的理论研究，通过设计不同种类的筛选条件可以比较全面的对蛋白质是否具有相分离能力进行判断。在本发明中，可基于384筛选条件以及不同样品蛋白的筛选结果，进一步对384条件进行优化，在具备所有筛选条件的前提下，将384个条件继续缩小，比如可缩小到176个条件或其他的优化条件。96条件在本发明中，基于384筛选条件以及不同样品蛋白的筛选结果，进一步对384条件进行了优化，在具备所有筛选条件的前提下，将384个条件缩小到了96个条件，同样也包含了384条件中的六大类筛选试剂。不同于384筛选中酶标仪的测定，将样品与试剂混合之后通过显微镜直观的去观察蛋白是否发生相分离现象，然后根据观察结果按照我们提供的标准进行打分，热图可以直观的提供蛋白样品的相分离能力。蛋白质相分离表征方法本发明提供了一种能够系统地表征蛋白质相分离的方法，所述方法采用高通量技术，通过合理的变量设计，在一次实验中即可对蛋白质相分离能力进行量化鉴定。所述的方法包括以下步骤：(a)表达纯化目的蛋白；(b)控制m个变量，制备第1-第n筛选试剂，并分别将步骤(a)的目的蛋白与所述的第1-第n筛选试剂混合，从而获得第1-第n混合溶液；和(c)用显微镜扫描步骤(b)的第1-第n混合溶液，对其中蛋白凝聚现象进行观察并打分；其中，n为正整数，且所述的m个变量各自独立地选自下组：缓冲溶液、盐、高聚物、正电荷试剂、负电荷试剂、生物试剂、高聚物、筛选试剂的ph值、蛋白结合剂(例如mrna或小分子药物等需要与蛋白结合的试剂)。在另一优选例中，所述方法还包括：(c’)用酶标仪扫描步骤(b)的第1-第n混合溶液，测定400nm波长下的od吸收值。在另一优选例中，所述步骤(b)在96条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(b)在384条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(c)在96条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(c’)在384条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(b)在96条件下进行时，步骤(c)在96条件下进行。在另一优选例中，所述步骤(b)在384条件下进行时，步骤(c’)在384条件下进行。各个变量可以单独控制，也可以以交叉方式控制(例如通过正交试验设计)，例如，在一组实验中同时控制溶液ph和缓冲体系。优选地，所述的控制变量即包括控制对应组分在所述的筛选试剂中存在或不存在，也包括控制对应试剂的种类，以及对应试剂在所述的筛选试剂中的水平(浓度或ph值高低)。在一个示例性的实验中，在控制缓冲溶液变量时，所述的缓冲溶液是选自下组的溶液：bis-tris、citricacid、hepes、tris。所述的缓冲溶液浓度水平可以为0.025mm-0.1m，例如0.025mm和0.1m两种水平。在控制盐变量时，所述的盐可以是一价阳离子盐或者二价阳离子盐，较佳地选自下组：zn(ac)2、ca(ac)2、mg(ac)2、mgso4、mncl2、mnso4、nacl、kac、naac、(nh4)2so4、licl、nh4cl、mgcl2、或其组合。所述的盐的浓度可以为0.05-3m，例如0.05m、0.1m、0.2m、2m、3m五个水平。在控制高聚物变量时，所述的高聚物可以选自下组：dextran10、dextran40、dextran70、ficoll400、peg3350、peg500、peg8000。所述的高聚物的浓度可以为5％-60％w/v，较佳地，10％-60％w/v，例如5％w/v、10％w/v、15％w/v、20％w/v、25％w/v、40％w/v六个水平。在控制生物试剂变量时，所述的生物试剂可以选自下组：cr20、cr7、heparin、polyu。所述的生物试剂的浓度可以为2μm-1000μm，例如20μm、100μm、200μm、1000μm四个水平。在控制筛选试剂变量时，所述的筛选试剂的ph值可以为3.5-8.5，例如3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5五个水平。一种优选的筛选试剂设计方案如图6或图7中所示。在混合目的蛋白与筛选试剂后，对于混合后的样本的聚集程度进行打分。所述的打分包括：按照下列标准给予各个混合溶液-1分至3分的打分：。在另一优选例中，所述的打分包括按所测得的od值进行分类并用不同的颜色加以区分：在另一优选例中，所述的目测浊度以图1为例，其中，a为0分样品，b为-1分样品，c为1分样品，d为2分样品，e为3分样品。在一个优选的实施方式中，还可以根据所述的打分结果，绘制r热图，示例的r热图如附图2中所示。所得到的打分结果可以通过数据处理从而得出蛋白质的相分离性能，在本发明的实施例中，根据所述的打分结果，得到各个混合溶液的打分之和tp，且当tp＞0时，判断该蛋白具有相分离能力，当tp＞n时，判断该蛋白具有强相分离能力，其中n为12－45。另一种优选的实施方式中，可以根据各组试验所控制的变量对于各个样品进行分组，并计算每组变量下各个样品的得分平均值tp1、tp2、……、tpm，得到各个样品的得分平均值之和tp。当tp＞0时，判断该蛋白具有相分离能力，当tp＞m时，判断该蛋白具有强相分离能力，其中，m为12－45。应理解，上述方法也可以用于其他与蛋白的相分离性能有关的实验。例如，可以通过对该方法进行改造，从而构建更加复杂的相分离模型来高通量研究相分离，比如高通量研究相分离状态下的rna结合蛋白是否可以特异性招募某类特定功能的mrna。在这一情况下，可以在控制的变量中增加该特定功能mrna。另外，因为某些相分离蛋白的相分离状态和一些神经退行性疾病密切相关，因此也可以高通量地筛选不同药物小分子对蛋白相分离状态的影响。本发明的主要优点包括：本发明的鉴定相分离蛋白体系和方法可以实现使用微克级蛋白对相分离蛋白快速高通量地筛选和鉴定。并且该高通量体系可以用以研究蛋白影响相分离能力的内在和外在因素。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。通用方法表达纯化目的蛋白将蛋白储存于合适的缓冲溶液中，保证目的蛋白能够在室温稳定存在一段时间(>12小时)。筛选试剂的制备非生物试剂储存于4℃，生物试剂易降解，冻存于-20℃。因为不同蛋白的等电点对蛋白液态-液态相分离影响较大，故采用较大的ph范围，另不同聚合物所产生的不同的“拥挤效应”会影响蛋白液态-液态相分离行为，而且有些蛋白的液态-液态相分离行为会受盐浓度的影响，综合以上几点设计筛选试剂。另外，生物试剂基于促进蛋白液态-液态相分离因素而设计，cr7与cr20为半胱氨酸和精氨酸组成的多肽(positivechargedagent)，heparin为肝素(negativechargedagent)，polyu为多聚尿嘧啶(negativechargedagent)。在本发明中，在96条件下，各个试剂的具体配方见下表(96条件)：。根据上述配方，可制备获得1-96种筛选试剂。在一优选实施方式中，在384条件下，各个试剂的具体配方见下表(384条件)根据上述配方，可制备获得1-384种筛选试剂。蛋白与筛选试剂预混利用mosquito机器人(来自ttplabtech)先将一定体积的蛋白(推荐0.75μl)滴于96孔悬滴膜(来自ttplabtech)正中央，将96个筛选条件(各条件对应的孔道见图6)与蛋白溶液混合(推荐混合比例1:1，并设置混匀程序)，迅速将悬滴膜压于玻璃片，并确保压实，使体系密封。利用排枪(来自eppendorf)先将一定体积的蛋白(推荐6ul)加入384孔板中(来自corning)，将384个筛选条件(推荐14ul)与蛋白溶液混合，使用封口膜密封。显微镜(leicam205fa，配有leicadfc450c显微镜)扫描并打分样品制备好后立即在高倍显微镜下呈现，观察不同条件下蛋白是否发生液态液态相分离形成凝聚的小液滴，以及形成小液滴的大小与多少，按照密集、稀疏、无现象、产生沉淀等级别进行打分，以分析促进蛋白相分离的不同因素，并用于比较在所给条件下蛋白相分离能力的大小。如图1所示：无现象记为0(图1a)；产生无规则聚集记为-1(图1b)；若有分散均匀的球状物存在视为发生液态-液态相分离，根据目测浊度，浊度低且球型液滴直径小于5μm记为1(图1c)；浊度高且球型液滴直径小于5μm或浊度低球型直径大于5μm记为2(图1d)；浊度高且存在较多球型直径大于5μm记为3(图1e)。浊度高低以图1为界。酶标仪(thermoscientificvarioskanflash3001-2035)测定od值样品制备好后立即在酶标仪中测定od值，通过测得的od值进行分类，获得蛋白在不同条件下相分离能力的强弱。实施例1.以200μmfus(1-214aa)为例，将打分结果以r热图(图2)形式展现。本发明用tp值，即96个条件下的分值之和，反应所给条件下目的蛋白液态相分离的能力。根据图2得到200μmfus的最终打分tpfus(1-214aa)＝96。此外，按照试剂不同，将96个条件归为以下15类(对应的孔道见图6)，图3中每一类条件标记为一种颜色。求得每组条件平均值之和tpfus(1-214aa)＝16.6，该值代表所测蛋白液态液态相分离能力相分离能力，tp值比tp值更具有代表意义。tp值大于0，该蛋白具有相分离能力，大于16的蛋白在实验浓度下具有较强的相分离能力。本发明体系可以用于比较目的蛋白相分离能力，以a蛋白和其损伤相分离能力突变体amut为例。50μma蛋白根据最终热图得到的tpa＝96，tpa＝15.10(图4)，而50μmamut对应的tpamut＝42,tpamut＝7.35(图5)。其中tpa＝15.10>tpamut＝7.35，充分说明a蛋白野生型液(a)态液态相分离能力明显强于突变体(amut)。实施例2以25umfus(1-214aa)为例，将测量结果以(图8)形式呈现。利用排枪将各筛选条件试剂加入384孔板中，然后将准备好的筛选样品利用排枪与筛选试剂混合，混合过程中避免产生气泡，然后通过酶标仪在400nm的波长下测定各孔的od吸收值，以测得的吸收值按照给出的分类标准以不同的颜色区别开，棕红色表示最强的相分离能力，由强到弱的相分离能力依次对应棕红色，红色，浅红色，淡粉色，蓝色，淡蓝色。通过热图的形式表示筛选样品在各条件下对应的相分离能力，图8显示了fus(1-214aa)蛋白在各条件下的相分离能力。在该实施例中，利用了fus(1-214aa)蛋白与384筛选试剂进行混合，在25um终浓度的条件下对测得的od值按照上述标准进行分类，根据图8热图显示的结果，可以看到fus(1-214aa)蛋白在正电荷试剂的环境下有明显的相分离现象，同时一系列不同的盐也可以促进fus蛋白的相分离发生。并且，发明人将384筛选试剂进一步优化为176筛选试剂时，也可观察到类似的结果。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。参考文献1.banani,s.f.,lee,h.o.,hyman,a.a.&rosen,m.k.biomolecularcondensates:organizersofcellularbiochemistry.naturereviews.molecularcellbiology18,285-298,doi:10.1038/nrm.2017.7(2017).2.decker,c.j.&parker,r.p-bodiesandstressgranules:possiblerolesinthecontroloftranslationandmrnadegradation.coldspringharborperspectivesinbiology4,a012286,doi:10.1101/cshperspect.a012286(2012).3.murakami,t.etal.als/ftdmutation-inducedphasetransitionoffusliquiddropletsandreversiblehydrogelsintoirreversiblehydrogelsimpairsrnpgranulefunction.neuron88,678-690,doi:10.1016/j.neuron.2015.10.030(2015).4.hernandez-vega,a.etal.localnucleationofmicrotubulebundlesthroughtubulinconcentrationintoacondensedtauphase.cellreports20,2304-2312,doi:10.1016/j.celrep.2017.08.042(2017).5.larson,a.g.etal.liquiddropletformationbyhp1alphasuggestsaroleforphaseseparationinheterochromatin.nature,doi:10.1038/nature22822(2017).6.hubstenberger,a.etal.p-bodypurificationrevealsthecondensationofrepressedmrnaregulons.molecularcell68,144-157.e145,doi:10.1016/j.molcel.2017.09.003(2017).7.khong,a.etal.thestressgranuletranscriptomerevealsprinciplesofmrnaaccumulationinstressgranules.molecularcell68,808-820e805,doi:10.1016/j.molcel.2017.10.015(2017).当前第1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