一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用与流程

本发明属于免疫检测领域，尤其涉及饲料与谷物产品中快速测定检测呕吐毒素技术领域。更具体地，涉及一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术：

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，缩写don)是一种常见的b型单端孢霉烯族毒素，是单端包菌素烯烃中的一种，它通常由谷类物品(如小麦、玉米和大麦等)中的霉菌、镰红菌素生成。大剂量的呕吐毒素可引发人、猪、反刍动物、小鼠以及家禽等出现呕吐症状，故又俗称为“呕吐毒素”，可使人和动物体重减轻，腹泻，扰乱肠道系统的稳态、并影响内分泌系统及免疫系统等，并能通过血液循环到达血脑屏障，从而造成潜在的神经毒性。don抑制蛋白质的合成、细胞的增殖，从而可能导致基因毒性、细胞毒性等。其中，雄性动物对don更为敏感。猪是对don最敏感的动物，当饲料中don浓度达到1～2ppm就会使采食量降低(preluskyetal.,1994)。

don固体是无颜色的针状结晶，熔点大约为151～153℃左右，闪点为-3℃，储存条件为2～8℃，应与食品原料分开存放。don具热稳定性，能耐170～350℃的高温，并耐酸碱，在低压条件下其结构很难破坏，只有在高压或加碳酸钠等碱性条件下才能破坏大量毒性，通常呕吐毒素贮藏四至五年后，其毒性仍能保留。研究表明，呕吐毒素可能对免疫系统有影响，有明显的备胎毒性和一定的致畸作用。由于呕吐毒素的危害严重，引起了各国的普遍重视。中国、巴西、美国、阿根廷和南非等世界各地均有don污染粮食的报导。2016年在中国山东调查了359份面粉样品的霉菌毒素污染状况，发现don的检出率最高，达到97.2％，平均污染浓度为86.7μg/kg(lietal.,2016)。不仅在粮谷作物中don的污染严重，在饲料原料及全价配合饲料中的污染也很普遍。2012～2014年，随机收集的我国中部地区饲料及配合饲料190份，don的阳性率为77.4％(liuetal.,2016)。因此，谷物及饲料中对呕吐毒素的含量均有严格的限量标准。我国谷物、猪配合饲料、犊牛配合饲料和泌乳期动物配合饲料中呕吐毒素的限量标准为1.0mg/kg，而牛配合饲料和家禽配合饲料中呕吐毒素的限量标准为5.0mg/kg。

目前检测呕吐毒素的方法有很多种，如薄层色谱法、酶联免疫吸附法(elisa)、气相色谱、高效液相色谱法、紫外线光谱分析法和胶体金免疫层析法。其中，仪器法灵敏、准确、但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测成本较高、而且需要专业人员操作，从而限制了其应用。中国专利文献cn101413954a公开了一种呕吐毒素的酶联免疫吸附检测专用测试盒及制备及检测方法。但诸如酶联免疫分析、化学发光免疫分析等传统免疫分析方法，虽然简单，但灵敏度较差又比较，另外其检测流程仍需实验室条件保障，检测操作依旧需要专业人员进行，一般仍需要利用酶标仪等较为大型的专业仪器进行辅助检测，且很难单份操作，在没有条件开展实验室检测的边远地区或基层医疗机构中，该方法是不利于粮食和饲料的及时检测和大面积筛查的。

免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，通过抗原抗体结合的免疫反应原理，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测线)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验结果(如检测线出现不同颜色的条带)；而游离标记物则越过检测线，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的目测标记载体有胶体金、乳胶、胶体硒等，其中运用最成功的标记物为胶体金。但是，胶体金免疫层析试纸条存在以下缺陷：(1)一般试纸条均为通过肉眼观察结果进行定性分析，无法实现精准的定量检测；(2)不同的材料基质效应明显，样本背景干扰较大，易产生假阳性结果；(3)检测的阳性结果无法保存，通常超过判断时间后，结果不再准确可靠。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该荧光免疫层析试纸条具有定性定量检测呕吐毒素的能力，检测特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、检测时间短、适合于批量样品的筛选检测，是理想的快速筛选手段，能更好地满足我国谷物及饲料企业、政府职能监管部门等展开检测工作。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，包括底板，所述底板上贴有反应膜；反应膜的一端覆盖吸水垫，另一端依次覆盖结合垫和样品垫；所述反应膜的非覆盖面上沿横向设置有检测线和质控线；

所述结合垫上喷涂有聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针；

所述检测线上包被有呕吐毒素完全抗原，所述质控线上包被有山羊抗鼠二抗抗体。

作为其中一优选方案，所述反应膜粘贴在底板上；所述吸水垫粘贴在反应膜一侧；所述样品垫和结合垫从上至下依次粘贴在反应膜的另一侧。所述吸水垫和反应膜之间、结合垫和反应膜之间、结合垫和样品垫之间的相互重叠部分约为1～1.5mm，其他部分粘贴于底板上。

作为其中一优选方案，本发明所采用的吸水垫为吸水滤纸，所述底板为聚氯乙烯(pvc)底板，所述反应膜为硝酸纤维素膜(nc膜)，所述样品垫和结合垫为玻璃纤维素膜。试纸条长度为6.5～10cm，宽度为3.5～5cm。吸水垫长度为2.2～4cm，反应膜长度为2.6～4cm，结合垫长度为0.5～1cm，样品垫长度为1.8～3cm。

作为其中一优选方案，所述聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针，是将活化后的聚集诱导发光荧光微球与呕吐毒素单克隆抗体按体积比8～12：1偶联后，加入牛血清蛋白(bsa)作封闭液得到。

作为其中一优选方案，所述聚集诱导发光荧光微球的活化方法为：向羧基化的聚集诱导发光荧光微球溶液中，加入由碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)组成的活化剂进行活化得到；所述羧基化的聚集诱导发光荧光微球溶液与edc和nhs的体积比为1～3：3：4。

作为其中一优选方案，所述聚集诱导发光荧光微球采用四联苯乙烯酸四甲酯制备而成，具体包括以下步骤：

将四联苯乙烯酸四甲酯和微球制备材料(聚甲基丙烯酸甲酯、聚马来酸酐十八醇酯)溶于三氯甲烷溶剂，加入分散剂进行分散得到分散液；在冰浴条件下，将分散液制成微乳后除去三氯甲烷，离心取沉淀物，清洗沉淀物后，将沉淀物复溶于缓冲液中，制得聚集诱导发光荧光微球。

作为其中一优选方案，所述呕吐毒素完全抗原是：以式(i)所示化合物为呕吐毒素半抗原，与载体蛋白偶联，得到呕吐毒素完全抗原；

其中，呕吐毒素半抗原为式(i)所示化合物：

作为其中一优选方案，所述呕吐毒素半抗原的制备方法如下：将呕吐毒素溶解于乙二醇二甲醚中，加入氢化钠将呕吐毒素的羧基活化后偶联上丁二酸酐，避免呕吐毒素4号位和5号位的羧基被取代，再利用3-溴丙酸甲酯取代呕吐毒素4号位和5号位羧基上的氢，再于碱性条件下还原丁二酸酐，即得式(i)所示化合物。

作为其中一优选方案，所述呕吐毒素半抗原的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将呕吐毒素超声溶解于乙二醇二甲醚中；

(2)向氢化钠中加入溶解好的呕吐毒素将呕吐毒素的羧基活化(由于氢化钠里含有煤油，使用石油醚进行清洗2～3次；最后一次倒掉石油醚后，使用氮气吹干)，搅拌反应1～2h；

(3)加入0.5～1.0g丁二酸酐，搅拌反应3～4h；继续反应1h后，缓慢滴加3-溴丙酸甲酯反应3～4h，进行萃取纯化，即得。

在制备所述呕吐毒素半抗原中，为了验证是否水解成功，将上述步骤(3)的产物和呕吐毒素一起点板(氯仿：甲醇＝30：1)；过滤后蒸发；加入氢氧化锂和15ml三级水，搅拌1h，如果溶解比较澄清，证明水解成功。水解成功后，向水解产物中加入水和乙酸乙酯进行萃取2～3次，取水层产物；向水层产物中滴加浓盐酸至ph值为4～5，出现沉淀产物后，用乙酸乙酯把水层的产物萃取回来；最后，以乙酸乙酯和无水硫酸钠为除水剂除去水分，旋转蒸发，即可得到纯化后的式(i)所示的呕吐毒素半抗原。

作为其中一优选方案，所述呕吐毒素单克隆抗体是：以式(i)所示化合物为呕吐毒素半抗原，与载体蛋白偶联，得到呕吐毒素完全抗原；以该呕吐毒素完全抗原作为免疫原，去免疫动物发生特异性免疫反应后，获得呕吐毒素单克隆抗体。

作为其中一优选方案，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白(ova)或牛血清蛋白(bsa)。

作为其中一优选方案，ova作载体的完全抗原用来作包被原，bsa作载体的完全抗原用来作免疫原。

本发明还涉及了所述呕吐毒素荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

s1.将呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联，得到呕吐毒素完全抗原；以该呕吐毒素完全抗原作为免疫原去免疫动物，发生特异性免疫反应后，获得呕吐毒素单克隆抗体；

s2.采用碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化后的羧基化的聚集诱导发光荧光微球，对呕吐毒素单克隆抗体进行标记，加入牛血清蛋白(bsa)溶液进行封闭，得到聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针；

然后将聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针喷涂于结合垫上；

s3.在反应膜的检测线位置包被呕吐毒素完全抗原，检测线包被浓度为0.6～1.4mg/ml；在反应膜的质控线位置包被山羊抗鼠二抗抗体，质控线包被浓度为1.6～2.4mg/ml；

s4.在底板上依次搭接样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，即得。

作为其中一优选方案，呕吐毒素单克隆抗体与聚集诱导发光荧光微球的质量体积比为1μg：6～14μl，于100～300rpm、24～26℃条件下进行偶联反应35～45min。

作为其中一优选方案，所述bsa溶液的用量为16～24μl，浓度为16％～24％。

作为其中一优选方案，步骤s2具体操作如下：

a、向聚集诱导发光荧光微球溶液中加入2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)缓冲溶液，混匀后离心：所述聚集诱导发光荧光微球溶液是羧基化的聚集诱导发光荧光微球，激发波长为200nm，发射波长为610nm；

b、加入0.5～1mg/ml的edc和0.5～1mg/ml的nhs，使用恒温培养摇床振荡于100～300rpm、24～26℃条件下催化15～45min；催化完毕后，在14000～20000rpm、24～26℃离心15～20min，弃掉上清液，复溶于1ml0.05m的bb缓冲溶液(ph＝8.0)中；

c、加入呕吐毒素单克隆抗体，放置恒温培养摇床振荡于100～300rpm、24～26℃条件下反应35～45min；

d、加入16～24μl的16％～24％bsa，放置恒温培养摇床振荡，于100～300rpm、18～22℃反应50～60min，得到免疫荧光探针；

e、将所获得的免疫荧光探针离心(于8000～20000rpm、24～26℃条件下离心10～20min)；

f、弃去上清液，加入1ml复溶液，于8000～20000rpm、24～26℃条件下离心15～25min；

g、弃去上清液，用聚集诱导发光荧光微球溶液将其稀释至200μl，用超声波清洗器超声使其悬浮，即可得到所述聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针。

所述质控线为c线，所述检测线为t线。

本发明采用甲醇原液和0.05mol/l的pb溶液对硝酸纤维素膜上的c线上的二抗、t线的抗原进行稀释。c线和t线均配置为30μl体系，均用甲醇和pb溶液稀释，甲醇溶液固定使用2μl，呕吐毒素完全抗原蛋白使用16μl，不足30μl部分加pb溶液补齐；山羊抗鼠二抗抗体使用6μl，不足30μl部分用pb溶液补齐。

反应膜检测线中各组分的含量分别为：呕吐毒素完全抗原(2mg/ml)为16～30μl，甲醇原液为2～30μl，0.05mol/ml的pb溶液为12～30μl；所述质控线中各组分含量分别为：山羊抗鼠二抗抗体抗体(1mg/ml)为6～30μl，甲醇原液为2～30μl，0.01mol/l的pb溶液为22～30μl。

本发明还涉及了一种定性定量检测呕吐毒素的方法，包括如下步骤：

(1)定性检测

在上述呕吐毒素荧光免疫层析试纸条的样品结合垫上加入待测样本，反应5～8min后，观察试纸条检测线和质控线出现的荧光情况(可直接借助紫外灯用肉眼观察)：

检测线和质控线都显示荧光，则待测样本中呕吐毒素的含量小于100ppb，定性判断为阴性；

检测线不显示荧光，质控线显示荧光，则检测样本中呕吐毒素含量大于等于100ppb，定性判断为阳性；

(2)定量检测

检测定性判断为阳性的试纸条的荧光强度，根据标准曲线得到检测样本中呕吐毒素的含量。

所述呕吐毒素荧光免疫层析试纸条在检测或监测饲料或食品中呕吐毒素的含量或水平中的应用，也在本发明的保护范围之内。

本发明所用的待测样品包括饲料、玉米蛋白粉、麦麸和红棕榈粕等。

本发明的试纸条是一种以硝酸纤维素膜为固相载体的快速诊断技术。将待测样品稀释25倍，总体积100μl滴加到样品垫上，样品在层析作用下向着吸水纸的方向迁移。当样品中不存在呕吐毒素时，释放垫上聚集诱导发光荧光微球标记物流经检测线时，与固定在检测线上的抗原结合，发生特异性反应，此时一部分聚集诱导发光荧光微球固定在检测线上，形成t线，未与抗原发生反映的免疫复合物继续向前迁移，流经质控线是被固定的二抗(山羊抗鼠二抗抗体)，发生特异性反应，使多余的聚集诱导发光荧光微球标记物滞留在质控线处，形成c线。如果还有剩余的聚集诱导发光荧光微球标记物，则继续会往吸水纸的放心迁移，c线出现肉眼可见的荧光条带；无论试纸条t线有无荧光条带，只要c线没有荧光条带时，该试纸条即为无效。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明获取的试纸条采用了新型合成的呕吐毒素半抗原，该半抗原结构稳定特异性强，具有很强的识别作用。

2、本发明获取的试纸条采用了聚集诱导发光荧光微球标记技术，经过对饲料样品的验证，特异性强，无交叉，反应仅需8分钟既可以观察结果，达到对呕吐毒素的检测。

3、本发明在现有聚集诱导发光荧光微球标记技术的基础上，改进实验技术，优化标记条件，选择edc和nhs联合作为活化剂，选用牛血清蛋白作为封闭液，提高了标记效率，标记过程简单快速，省去了对结合垫的处理步骤。

4、本发明使用的标记抗原为呕吐毒素完全抗原，该抗原是呕吐毒素半抗原与载体蛋白结合的蛋白偶合物，具有很高的抗原特异性。

5、本发明制备的试纸条所选用的聚集诱导发光荧光微球具有很高的稳定性，信号不易减弱，可用便携式荧光免疫分析仪进行检测，克服了现有技术如elisa操作繁琐、耗时耗力、需要专业人员检测、特异性等不足。

附图说明

图1是本发明呕吐毒素标准曲线。

图2是本发明呕吐毒素荧光免疫层析试纸条的示意图。

图3是本发明呕吐毒素荧光免疫层析试纸条判断定性结果的示意图。

图4是本发明呕吐毒素半抗原合成路线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

基础培养基：rpmi-1640。

实施例1呕吐毒素半抗原、完全抗原、单克隆抗体、山羊抗鼠二抗抗体的制备

1、呕吐毒素半抗原制备

本发明呕吐毒素半抗原的合成路线如图4所示，具体包括以下步骤：

(1)提前称取23.2mg呕吐毒素，加入10ml乙二醇二甲醚，超声溶解，备用；

(2)称取0.6g氢化钠(由于氢化钠里含有煤油，使用20ml石油醚磁力搅拌30s，静置2min，倒掉石油醚；重复进行清洗2～3次；最后一次倒掉石油醚后，使用氮气吹干)；

(3)向氢化钠中加入溶解好的呕吐毒素，搅拌1h，加入0.5g丁二酸酐，搅拌3h，反应1h后，慢慢滴加4ml3-溴丙酸甲酯，反应3h，得到产物，再进行萃取纯化，得到式(i)所示化合物：

在制备该呕吐毒素半抗原中，为了验证是否水解成功，将上述步骤(3)的产物和呕吐毒素一起点板(氯仿：甲醇＝30：1)；过滤后蒸发；加入2g氢氧化锂和15ml三级水，搅拌1h，如果溶解比较澄清，证明水解成功。水解成功后，向水解产物中加入水和乙酸乙酯进行萃取2～3次，取水层产物；向水层产物中滴加浓盐酸至ph值为4～5，出现沉淀产物后，用乙酸乙酯把水层的产物萃取回来；最后，以乙酸乙酯和无水硫酸钠为除水剂除去水分，旋转蒸发，即可得到纯化后的式(i)所示的呕吐毒素半抗原。

2、完全抗原(包被原、免疫原)的制备

(1)包被原的制备

1)取10mg呕吐毒素半抗原，溶解于1ml二甲基酰胺(dmf)中；取20mg碳二亚胺(edc)，用0.2mldmf充分溶解后加入半抗原溶液中，室温搅拌8h，即可得到反应液a；

2)称取ova36mg，使之充分溶解在3ml0.1mol/l碳酸盐缓冲溶液(ph＝9.6)中，得到ova蛋白溶液；

3)将反应液a逐滴缓慢滴加到ova蛋白溶液中，并于室温下避光搅拌16h，用0.01mol/l的pbs在4℃透析3天，每天换2次透析液液，得到包被原。

(2)免疫原的制备

1)取10mg呕吐毒素半抗原，溶解于1ml二甲基酰胺(dmf)中；取20mg碳二亚胺(edc)，用0.2mldmf充分溶解后加入半抗原溶液中，室温搅拌8h，即可得到反应液a；

2)称取bsa36mg，使之充分溶解在3ml0.1mol/l碳酸盐缓冲溶液(ph＝9.6)中，得到bsa蛋白溶液；

3)将反应液a逐滴缓慢滴加到bsa蛋白溶液中，并于室温下避光搅拌16h，用0.01mol/l的pbs在4℃透析3天，每天换2次透析液液，得到免疫原。

3、呕吐毒素单克隆抗体的制备

a、动物免疫：将步骤2得到的免疫原，注入balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清；

b、细胞融合和克隆化

加强免疫：正式细胞融合前三天加强免疫小鼠一次，注射浓度：1mg/ml，注射量：100μl，无需佐剂；

准备饲养细胞：正式细胞融合前一天，取昆明鼠1只，眼球放血处死，置于解剖板，取胸腔巨噬细胞和脾细胞作为饲养细胞和大约75ml左右hat培养基混合后加入到多孔培养板中，调节浓度在2×10⁵个/ml，取24孔培养板，1ml/孔。次日使用前需观察饲养细胞生长状况，如有染菌等异常现象，应弃之。

脾细胞液的制备：先在小细胞皿中加入3ml基础培养基，放上细胞筛，取出脾脏置细胞筛中，用注射器活塞研磨脾脏；收集脾细胞至15ml离心管中，用rpmi-1640基础培养基定容至10ml，封口；1000rpm离心7min弃上清；从温浴箱拿出tris-氯化铵，先加1mltri-氯化铵，轻轻吹散，再加入2mltri-氯化铵混匀(使红细胞裂解)，封口，37℃保温7min；加入rpmi-1640基础培养基定容至10ml，封口1000rpm离心7min，弃上清；用rpmi-1640基础培养基重悬至10ml得脾细胞液，备用。

骨髓瘤细胞液的制备：将骨髓瘤细胞收集至另一15ml离心管中，封口，1000rpm离心7min，弃上清，用基础培养基重悬，定容至10ml得骨髓瘤细胞液。

混合细胞液：脾细胞液和骨髓瘤细胞液至50ml离心管中混合，补加基础培养基至20ml，充分混匀，封口，1000rpm离心7min，弃上清，离心管口朝下用枪吸掉多余培养基。

细胞融合的准备：用手指轻轻敲打离心管底部的沉淀细胞团，使沉淀松散充分混匀，封口，37℃温育10min，准备计时器计时4min。

细胞的融合：从温浴箱拿出peg和10ml完全培养基；前1min内加入peg，动作轻柔，伴随轻轻搅拌，千万不要吹散，使peg分开；封口，37℃温育10min，800rpm离心10min，弃掉上清。

铺板：从温浴箱拿出hat，加入少量hat培养基，用吸管轻轻吸液放液，轻柔搅拌，再定容至75ml；加入到有饲养层细胞的24孔板中，1ml/孔，放置细胞培养箱培养。

融合后的培养：第4天检查是否需要添加hat培养液；第7天首次换液，换液时吸去1/2培养液，加入等量新鲜的ht培养液，用ht过度。

利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到可以稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制备成1*10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速溶，离心去除冻存液后，移入培养瓶中培养。

(4)单克隆抗体的制备和纯化

杂交瘤细胞系建立后，可根据需要大量制备单克隆抗体。采用腹水收集法：首先将液状石蜡或者降植烷500μl注射到balb/c小鼠腹腔，1～2周后向腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种大约10天左右可见小鼠腹部肿胀，在小鼠死亡之前处死小鼠，抽取腹水，腹水经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，得到最终的呕吐毒素单克隆抗体。

4、山羊抗鼠二抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原，对无病原体羊进行免疫，得到山羊抗鼠二抗抗体。

实施例2呕吐毒素荧光免疫层析试纸条的制备方法

1、聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针的制备

a、取10μl的聚集诱导发光荧光微球溶液，1mlmes缓冲溶液加入离心管，混匀，离心，备用；

所述羧基化的聚集诱导发光荧光微球，激发波长为200nm，发射波长为610nm。

b、每管加入15μl0.5mg/ml的edc和20μl0.5mg/ml的nhs，使用恒温培养摇床振荡，200rpm、25℃催化15min；催化完毕后，14000rpm、25℃离心15min，弃掉上清液，复溶于1ml0.05m的bb缓冲溶液(ph＝8.0)中；

c、加入1μl呕吐毒素单克隆抗体，放置恒温培养摇床振荡，200rpm、25℃反应40min；

d、加入20μl的20％bsa，放置恒温培养摇床振荡，200rpm、20℃反应60min，得到免疫荧光探针；

e、将所获得的免疫探针于14000rpm、25℃离心15min；

f、弃去上清液，加入1ml复溶液，于14000rpm、25℃离心20min；

g、重悬：弃去上清液，用聚集诱导发光荧光微球溶液将其稀释至200μl，用超声波清洗器超声使其悬浮，即可得到所述聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针。

2、结合垫的制备

取结合垫一张，用按照长15cm，宽0.5cm的尺寸进行剪裁。取2.5μl的0.1mol/l的聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针，用ph＝7.2～7.4磷酸盐缓冲溶液(pbs)稀释至150倍，均匀喷涂在结合垫上，加入干燥剂，密封保存，备用。

3、反应膜(硝酸纤维素膜)的包被

(1)选择山羊抗鼠二抗抗体，稀释至1.0mg/ml浓度，喷膜作c线(质控线)；

(2)选择呕吐毒素完全抗原，稀释至2.0mg/ml浓度，喷膜作t线(检测线)；

(3)将山羊抗鼠二抗抗体溶液和呕吐毒素完全抗原溶液吸入划膜仪吸头，划膜仪喷量t线调至0.6μl/cm，c线调至1.0μl/cm，将硝酸纤维素膜放到相对湿度20％、温度37℃条件下，干燥2～3小时。

4、反应膜(硝酸纤维素膜)的制备

将步骤3获得的反应膜(硝酸纤维素膜)，按实际要求剪裁后，加入干燥剂，密封，保存，备用；

5、样品垫的制备

将玻璃纤维素膜材质的样品垫，按实际要求剪裁后，加入干燥剂，密封，保存，备用；

6、吸水垫的制备

将吸水滤纸材质的吸水垫，按照实际要求剪裁后，密封，干燥，备用；

7、底板的制备

将pvc材质的底板，按照实际要求剪裁后，密封，备用。

8、试纸条及其组装方法

如图2所示，一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，包括底板，底板上贴有反应膜；反应膜的一端覆盖吸水垫，另一端依次覆盖结合垫和样品垫(样品垫和结合垫从上至下依次粘贴在反应膜的另一侧)；反应膜的非覆盖面上沿横向设置有检测线和质控线；结合垫上喷涂有聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针；检测线上包被有呕吐毒素完全抗原，质控线上包被有山羊抗鼠二抗抗体。吸水垫和反应膜之间、结合垫和反应膜之间、结合垫和样品垫之间的相互重叠部分约为1～1.5mm，其他部分粘贴于底板上。

本发明所采用的吸水垫为吸水滤纸，底板为聚氯乙烯(pvc)底板，反应膜为硝酸纤维素膜(nc膜)，样品垫和结合垫为玻璃纤维素膜。试纸条长度为6.5～10cm，宽度为3.5～5cm。吸水垫长度为2.2～4cm，反应膜长度为2.6～4cm，结合垫长度为0.5～1cm，样品垫长度为1.8～3cm。

该试纸条组装方法，包括对底板两端的吸水纸、反应膜、结合垫、样品垫进行粘贴步骤：

(1)将步骤7制备的底板表面保护膜揭开；

(2)将步骤4制备的反应膜粘贴在底板的反应膜粘贴区域，压紧；

(3)将步骤6制备的吸水垫与反应膜的一侧重叠1～1.5mm，压紧；

(4)将步骤2制备的结合垫与反应膜的另一侧重叠1～1.5mm，压紧；

(5)将步骤5制备的样品垫与结合垫一侧重叠1～1.5mm，压紧；

(6)将组装好的试纸条，放置自动斩切机上，按照长6.5cm*宽3.5mm进行切割，加入一定量干燥剂后，室温密封保存；组装工作在室温、干燥的环境下进行；所有试纸条组装完成以后，加入干燥剂转入铝箔袋中，抽干空气，储存于常温下，备用。

实施例3使用上述荧光免疫层析试纸条进行呕吐毒素残留的检测

1、样品的前处理

将待检样品(饲料)研碎成粉末；称取1.00±0.05g粉碎后样品于10ml离心管中；加入6ml的70％甲醇-水溶液，涡动3min，4000rpm离心5min；取50μl上清液，添加450μl样品稀释液，混匀，待测。

2、用试纸条进行检测

打开试纸筒，取出实施例2制备的试纸条，做好标记并置于桌面上(注：取出微孔和试纸条后，立即盖好筒盖，以防受潮)；吸取待检样品100μl，滴入试纸条插入荧光探针微孔中，使样品垫充分浸入样品中，并反应5min；取出试纸条，在干式荧光分析仪中判读结果，在1min内判读结果。

实施例4样品检测实例

1、检测限试验

取呕吐毒素10000μg/k标准品，分别稀释至如表1，测出t/c荧光比值。

表1标准品对应的t/c值

从图1结果看，从0～1500ng/ml的浓度，t/c比值逐步降低，且到1500ng/ml以后t值信号变得很低，1000ng/ml与1500ng/ml的差别很小。在0～1000μg/kg的浓度范围内结果全程可测量。说明本发明的检测呕吐毒素的试纸条可以对谷物及饲料中呕吐毒素残留进行快速检测。

2、添加回收试验

取空白阴性样品，添加指定浓度的标准品，用三批实施例2制备的试纸条进行检测，计算回收率。结果见表2。

表2样品添加回收的检测结果

3、与lc-ms/ms的对比结果

取样品受污染的样品各一份，采用国标液相色谱法进行测定，再使用实施例2制备的呕吐毒素荧光定量检测试纸条进行检测，各测试3个平行样。检测结果如下表3。

表3与lc-ms/ms的对比结果

上述实验符合率在90％～100％之间，说明本发明检测呕吐毒素的试纸条可以准确地对谷物及饲料中呕吐毒素残留进行快速检测。

4、特异性试验

用实施例2制备的呕吐毒素试纸条检测500μg/kg玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a等药物。结果显示，试纸条质控线和检测线均荧光呈阴性。说明该试纸条对500μg/kg玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素a等药物无交叉反应。

上述结果说明，本发明提供的呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，大大简化了标记步骤，提高了标记效率，缩短了检测时长，还具有特异性强、稳定性好、样品用量少等优点，且偶联抗体为化学键偶合，比胶体金物理吸附稳定性好，检测准确度和精密度高；批次间差异性小成本低；另外，本发明呕吐毒素荧光免疫层析试纸条的检测方法操作简单，整个检测过程仅需要8min，检出限100ppb，定量检测范围100ppb～5000ppb，灵敏度高。

申请人声明，以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。