基于芬顿反应构建的ELISA可视化检测试剂盒及其在检测ZEN中的应用的制作方法

本发明属于食品分析领域，具体涉及一种基于芬顿反应对aunrs的刻蚀作用构建的新型酶联免疫反应（elisa）可视化检测试剂盒及其在检测玉米赤霉烯酮（zen）中的应用。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zenralenone，zen)又称f-2毒素，主要是由粉红镰刀菌及禾谷镰刀菌产生的一种非甾体。zen不仅具有动物雌性激素作用，还是某些真菌的性激素。zen能引起动物流产、死胎、返情等生殖机能异常，还可以导致生长下降、免疫抑制、不育、畸形等。由于我国多数地区雨量充沛，相对湿度较高，谷物和动物饲料更易受到霉菌毒素污染，尤其玉米、小麦、燕麦和大麦等作物易受到zen污染。通过国内外对zen毒性机理的研究发现它主要通过影响机体的生殖性能，引起细胞凋亡、致畸、损伤dna、氧化损害、影响免疫机能等机制，来影响动物与人类的健康。通过对zen毒性的研究发现它对植物的毒性主要体现在它与植物的受精、授粉有关，而它对动物的毒性主要体现在它具有生殖发育毒性、免疫毒性、肝肾毒性及它对内分泌系统的影响。

调查发现zen在饲料厂抽取的样品中污染最大，而在粮食集散地、养殖场（户）中污染最轻。这与饲料厂中玉米类样品较多而玉米类样品受到zen污染最严重有关。当猪食用了被zen污染的饲料后，育肥猪除精神轻度兴奋、食欲轻度下降外，主要表现为泌尿生殖器官的发情样症状。动物一旦食用了被zen污染的饲料后没有特效药能够对它们进行治疗，所以zen的检测变得尤为重要。

检测zen的方法主要有色谱法和免疫学方法。色谱法如气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法等，具有检测灵敏、可靠的特点，但是需要昂贵仪器，并且检测所需时间长，对操作人员要求较高。免疫学方法具有简便、灵敏、快捷、成本低、适合大批量检测等特点，尤其适合我国很多生产企业单位的自检。目前国内外对利用酶联免疫吸附测定法(elisa)检测zen有较多研究，并取得了一定成果。但是与进口试剂盒相比，国内的检测试剂盒存在检测范围较窄、灵敏度不高的缺点。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种基于芬顿反应构建的新型酶联免疫反应（elisa）可视化检测试剂盒，其是在elisa反应的基础上，引入aunrs作为显色底物，以改变传统elisa单一显色的问题。本发明基于芬顿反应构建新型elisa可视化检测试剂盒对zen进行检测，是在zen和人工抗原zen-cat可与抗体结合特异性的基础上，利用芬顿反应对aunrs的刻蚀作用导致aunrs颜色改变达到显色的效果，以最终通过aunrs的颜色变化对zen浓度进行可视化检测及精确定量测定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于芬顿反应构建的elisa可视化检测试剂盒，其包括zen单克隆抗体、人工抗原zen-cat、h2o2、fecl2和金纳米棒（aunrs），其利用fe²⁺的催化作用加速h2o2对aunrs的刻蚀，而通过aunrs的颜色变化进行测定。

所述人工抗原zen-cat的合成包括半抗原的合成及人工抗原的合成两个部分，其具体步骤为：

（1）半抗原的合成：精确称取1mgzen溶于0.4ml吡啶中，加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐（cmo），室温搅拌反应24h后，45℃真空干燥，残留物溶于0.4ml蒸馏水中，用1mol/l的naoh溶液调ph至8.0，然后用0.4ml苯反复萃取3次以从水相中除去未反应的zen，反应产物用hcl调节ph至3.0，生成沉淀，然后用0.5ml乙酸乙酯抽提4次，再于45℃真空干燥，得zen-cmo半抗原；

（2）人工抗原的合成：将n,n-二环己基碳二亚胺（dcc）、琥珀酰亚胺（nhs）和步骤（1）所得半抗原按质量比5:2:1溶于1mln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室温搅拌反应2h后，4℃搅拌继续反应24h，再于3000r/min离心10min，然后取上清液缓慢滴加入预冷的1.5ml、2.3mg/ml的过氧化氢酶（cat）溶液中，4℃搅拌反应24h，反应液用2l、0.01mol/l、ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液（pbs，其是将4gnacl，1.45gna2hpo4•12h2o，0.1gkcl，0.2gkh2po4溶于双蒸水ddh2o中并定容到1000ml制得）透析3天，得到所述人工抗原zen-cat。

所述aunrs的制备包括纳米金核的制备及金纳米棒的生长两个部分，其具体步骤为：

（1）将250μl、10mmol/l的氯金酸（haucl4）溶液加入到9.75ml、0.1mol/l的十六烷基三甲基溴化铵（ctab）溶液中，放置于30℃水浴中，以700r/min的转速磁力搅拌，混合均匀；然后调节磁力搅拌机转速为1200r/min，将0.9ml、10mmol/l冷冻新制的硼氢化钠（nabh4）溶液快速加入上述溶液中，剧烈搅拌2min后停止搅拌，并将磁力搅拌子取出，再将反应液于30℃水浴中静置30min，得纳米金核溶液（制备的金核溶液必须在2h内使用）；

（2）称取3.425gctab置于250ml平底烧瓶中，加入100ml超纯水，随后加入960μl、10mmol/l的agno3溶液，30℃静置15min，随后加入5ml、10mmol/l的haucl4溶液，700r/min持续搅拌90min；

（3）在步骤（2）所得溶液中加入640μl、100mmol/l的抗坏血酸（aa）溶液，1200r/min剧烈搅拌30s后，再往溶液中加入450μl步骤（1）制得的纳米金核溶液，1200r/min持续剧烈搅拌30s后停止搅拌，并将磁力搅棒子取出，30℃水浴静置12h以上，待aunrs生长完全；

所得aunrs的长径比约为3.8。

所述elisa检测试剂盒可用于zen的检测，如对饲料中zen的检测。其应用方法具体为：将50μlzen单克隆抗体包被在酶标板上，同时向孔中加入50μl含zen的待测物以及50μl人工抗原zen-cat，于37℃下孵育30min，使zen和zen-cat竞争酶标板上的单克隆抗体，用含tween20的磷酸盐缓冲溶液（pbst，其是将5mltween20，4gnacl，1.45gna2hpo4•12h2o，0.1gkcl，0.2gkh2po4溶于双蒸水ddh2o中并定容到1000ml制得）洗板三次，甩干后加入50μl含h2o21mol/l的pbs溶液，于37℃下孵育10min，用pbst洗板三次，甩干后再加入50μl10mmol/l的fecl2溶液和100μlaunrs，于室温下反应10min后，加入终止液h2so4终止反应，通过观察aunrs的颜色变化判断zen的浓度，或通过测定450-900nm处的紫外吸收值来对zen的浓度进行准确定量测定。

在室温条件下高浓度的h2o2会与aunrs发生氧化还原反应，使得aunrs的长径比发生改变，并且在当存在有ctab为软模板时，aunrs与氧化剂之间的氧化还原反应优先从aunrs的两端进行，aunrs的长度逐渐缩短，而直径基本不发生变化。但在室温条件下，低浓度的h2o2（<100mmol/l）与aunrs之间的反应需要长达12h才能够将aunrs完全氧化。而在芬顿反应中，fe²⁺作为催化剂将h2o2分解为·oh和·ooh，由于·oh的氧化能力远远高于h2o2的氧化能力，因此采用芬顿反应后的产物与aunrs反应，能够大大缩短反应时间。即本发明通过芬顿反应产生的羟基自由基，提高了h2o2与aunrs之间的反应速率。

本发明基于芬顿反应对aunrs的刻蚀作用构建了一种新型elisa可视化检测试剂盒，其根据目标物zen与人工抗原和zen单克隆抗体的特异性结合作用，使目标物与人工抗原zen-cat竞争酶标板上的单克隆抗体，再通过洗板、甩干等操作，使结合上抗体的人工抗原zen-cat留在酶标板上，此时再加入h2o2，cat就会分解h2o2，再加入fecl2和aunrs，未被分解的h2o2就会在fe²⁺的催化下加速对aunrs的刻蚀，aunrs被刻蚀之后，纵向等离子共振吸收峰会发生蓝移，长径比也会发生改变，导致aunrs的颜色发生变化，所以可以直观用肉眼观察颜色变化来大致对zen的浓度进行半定量的分析，另外也可以利用aunrs纵向等离子共振吸收峰对应的吸光值的大小来进行精确的定量分析。

相比现有技术的不足，本发明的优点：

1.本发明利用芬顿反应对aunrs的刻蚀作用构建的新型elisa可视化检测试剂盒，其通过fe²⁺加速h2o2对aunrs的刻蚀作用，使aunrs的颜色发生变化，从而可实现对zen浓度的粗略半定量检测以及精确定量分析。

2.本发明所使用的aunrs被h2o2刻蚀之后会呈现蓝色、绿色、浅红色、黄色等多种颜色，即具有多重显色性，是一种优良的显色底物。

3.本发明所使用的aunrs通过种子生长法制备获得，其以十六烷基二甲基溴化铵作为生长溶液，制备出的aunrs长径比约为3.8，具备良好的多重显色性。

4.本发明在检测过程中不需要复杂的仪器和繁琐的操作，每次检测所需的aunrs的量极少（50μl），检测成本低。

5.本发明检测zen的线性范围为0.2-4000ng/ml，检测限为0.2ng/ml，检测的灵敏度高、选择性好，检测过程简便，经济成本低，稳定性好，易于推广使用。

附图说明

图1为在芬顿反应中不同浓度的h2o2刻蚀aunrs不同时间的紫外吸收光谱图，其中，(a)0.04mmol/lh2o2；(b)0.2mmol/lh2o2；(c)1mmol/lh2o2；(d)5mmol/lh2o2。

图2为在芬顿反应中不同浓度的h2o2对aunrs的紫外吸收光谱图（a）、显色图像（b）和tem图像（c），其中，1-13代表h2o2的浓度分别为0、1、2、3、4、5、10、40、50、60、600、800和1000mmol/l，tem标尺为50纳米。

图3为人工抗原zen-cat的鉴定结果；其中，（a）为紫外线吸收鉴定zen-cat，（b）为sds-page鉴定zen-cat，泳道1是260μg/mlcat，泳道2和3是zen-cat，（c）为wb鉴定zen-cat，泳道1是260μg/mlcat，泳道2，3和4是zen-cat。

图4为反应过程中反应时间的优化情况图。

图5为反应过程中fecl2浓度的优化情况图。其中，（a）、（b）、（c）分别为反应时间为5min、10min、20min时加入不同浓度fecl2的紫外吸收光谱图，（d）为显色照片。

图6为与不同浓度的zen反应后的aunrs的紫外吸收光谱图（a）、吸光度与zen浓度之间的线性关系（b）及显色图像（c），其中，1-18代表zen的浓度分别为0、0.2、0.3、0.6、0.8、2、5、8、20、30、50、70、300、400、700、900、3000和4000ng/ml。

具体实施方式

一种基于芬顿反应构建的elisa可视化检测试剂盒，其包括zen单克隆抗体（购买自abcam）、人工抗原zen-cat、h2o2、fecl2和金纳米棒（aunrs）。

所述人工抗原zen-cat的合成包括半抗原的合成及人工抗原的合成两个部分，其具体步骤为：

（1）半抗原的合成：精确称取1mgzen溶于0.4ml吡啶中，加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐（cmo），室温搅拌反应24h后，45℃真空干燥，残留物溶于0.4ml蒸馏水中，用1mol/l的naoh溶液调ph至8.0，然后用0.4ml苯反复萃取3次以从水相中除去未反应的zen，反应产物用hcl调节ph至3.0，生成沉淀，然后用0.5ml乙酸乙酯抽提4次，再于45℃真空干燥，得zen-cmo半抗原；

（2）人工抗原的合成：将n,n-二环己基碳二亚胺（dcc）、琥珀酰亚胺（nhs）和步骤（1）所得半抗原按质量比5:2:1溶于1mln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室温搅拌反应2h后，4℃搅拌继续反应24h，再于3000r/min离心10min，然后取上清液缓慢滴加入预冷的1.5ml、2.3mg/ml的过氧化氢酶（cat）溶液中，4℃搅拌反应24h，反应液用2l、0.01mol/l、ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液（pbs，其是将4gnacl，1.45gna2hpo4•12h2o，0.1gkcl，0.2gkh2po4溶于双蒸水ddh2o中并定容到1000ml制得）透析3天，得到所述人工抗原zen-cat。

所述aunrs的制备包括纳米金核的制备及金纳米棒的生长两个部分，其具体步骤为：

（1）将250μl、10mmol/l的haucl4溶液加入到9.75ml、0.1mol/l的ctab溶液中，放置于30℃水浴中，以700r/min的转速磁力搅拌，混合均匀；然后调节磁力搅拌机转速为1200r/min，将0.9ml、10mmol/l冷冻新制的nabh4溶液快速加入上述溶液中，剧烈搅拌2min后停止搅拌，并将磁力搅拌子取出，再将反应液于30℃水浴中静置30min，得纳米金核溶液（制备的金核溶液必须在2h内使用）；

（2）称取3.425gctab置于250ml平底烧瓶中，加入100ml超纯水，随后加入960μl、10mmol/l的agno3溶液，30℃静置15min，随后加入5ml、10mmol/l的haucl4溶液，700r/min持续搅拌90min；

（3）在步骤（2）所得溶液中加入640μl、100mmol/l的aa溶液，1200r/min剧烈搅拌30s后，再往溶液中加入450μl步骤（1）制得的纳米金核溶液，1200r/min持续剧烈搅拌30s后停止搅拌，并将磁力搅棒子取出，30℃水浴静置12h以上，待aunrs生长完全；所得aunrs的长径比约为3.8。

基于芬顿反应对aunrs的刻蚀作用构建的新型elisa可视化检测试剂盒，通过fe²⁺加速h2o2对aunrs的刻蚀作用，导致aunrs的颜色发生变化，根据aunrs的颜色变化程度可判断出zen的大致浓度，或由aunrs纵向等离子共振吸收峰蓝移的紫外吸收曲线可以实现对zen浓度的精确定量。

图1为在芬顿反应中不同浓度的h2o2刻蚀aunrs不同时间的紫外吸收曲线图。如图1所示，在h2o2浓度为5mmol/l的条件下，以fe²⁺作为催化剂的芬顿反应，产物在10min内就能够将aunrs完全氧化，同时，高浓度的h2o2对aunrs的刻蚀程度相比低浓度的h2o2来说更加严重，即高浓度的h2o2使得aunrs的吸收峰蓝移更加明显，颜色变化也更快。

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1aunrs的合成与表征

（1）将250μl、10mmol/l的haucl4溶液加入到9.75ml、0.1mol/l的ctab溶液中，放置于30℃水浴中，以700r/min的转速磁力搅拌，混合均匀；然后调节磁力搅拌机转速为1200r/min，将0.9ml、10mmol/l冷冻新制的nabh4溶液快速加入上述溶液中（此时溶液应变为棕黄色；如果溶液变为红色，说明制备错误，应该重新制备），剧烈搅拌2min后停止搅拌，并将磁力搅拌子取出，再将反应液于30℃水浴中静置30min，得纳米金核溶液（制备的金核溶液必须在2h内使用）；

（2）称取3.425gctab置于250ml平底烧瓶中，加入100ml超纯水，随后加入960μl、10mmol/l的agno3溶液，30℃静置15min，随后加入5ml、10mmol/l的haucl4溶液，700r/min持续搅拌90min；

（3）在步骤（2）所得溶液中加入640μl、100mmol/l的aa溶液，1200r/min剧烈搅拌30s后，再往溶液中加入450μl步骤（1）制得的纳米金核溶液，1200r/min持续剧烈搅拌30s后停止搅拌，并将磁力搅棒子取出，30℃水浴静置12h以上，待aunrs生长完全。

在fe²⁺催化下，h2o2氧化aunrs的紫外吸收光谱图见图2。如图2所示，不存在h2o2时，aunrs的紫外吸收光谱图中有两个吸收峰，长轴等离子共振吸收峰（~765nm）和短轴等离子共振吸收峰（~510nm）。当加入h2o2之后，aunrs的长轴等离子共振吸收峰开始蓝移，同时吸收峰的强度也逐渐下降，并且随着h2o2浓度的增大，aunrs的长轴等离子共振吸收峰的峰位置的蓝移程度也随之增大。因此，aunrs与不同浓度的h2o2发生反应之后，溶液的颜色由最初的淡紫色，开始转变为淡红色、蓝色、绿色、无色、淡黄色、姜黄色等多种颜色。由此可见，不同颜色的溶液与h2o2的浓度之间呈现一定的相关性，因此可以通过溶液的颜色变化对h2o2的浓度进行可视化半定量分析。

进一步地，为了证明溶液的颜色发生改变是因为aunrs与h2o2反应之后长径比发生了变化，采用tem对反应前后aunrs的几何形貌进行表征。如图2中（c）所示，原始的aunrs溶液的颜色为红棕色，长径比为~3.8。当aunrs与h2o2反应之后，aunrs的长径比减少，溶液的颜色也从原来的淡紫色变为黄色。当h2o2的浓度较大时，aunrs由原始的棒状纳米颗粒开始转变为球形，溶液的颜色也相应的变为黄色。

实施例2人工抗原zen-cat的合成及鉴定

（1）半抗原的合成：精确称取1mgzen溶于0.4ml吡啶中，加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐（cmo），室温搅拌反应24h后，45℃真空干燥，残留物溶于0.4ml蒸馏水中，用1mol/l的naoh溶液调ph至8.0，然后用0.4ml苯反复萃取3次以从水相中除去未反应的zen，反应产物用hcl调节ph至3.0，生成沉淀，然后用0.5ml乙酸乙酯抽提4次，再于45℃真空干燥，得zen-cmo半抗原；

（2）人工抗原的合成：将n,n-二环己基碳二亚胺（dcc）、琥珀酰亚胺（nhs）和步骤（1）所得半抗原按质量比5:2:1溶于1mln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室温搅拌反应2h后，4℃搅拌继续反应24h，再于3000r/min离心10min，然后取上清液缓慢滴加入预冷的1.5ml、2.3mg/ml的过氧化氢酶（cat）溶液中，4℃搅拌反应24h，反应液用2l、0.01mol/l、ph=7.4的磷酸盐缓冲溶液（pbs）透析3天，得到人工抗原zen-cat。

为了对人工抗原zen-cat的合成结果进行鉴定，首先用考马斯亮蓝试剂盒检测人工抗原zen-cat的浓度，最后检测出zen-cat的浓度为260μg/ml。

①、紫外吸收初步鉴定人工抗原zen-cat

分别配制260μg/ml的cat溶液和zen溶液，与合成的zen-cat样品各取200μl于酶标孔中，测量230-400nm的吸收曲线。从图3中（a）可以看到，zen有2个紫外吸收特征峰，分别在274nm和316nm处；载体蛋白的紫外吸收特征峰主要在278nm处，然而人工抗原zen-cat的紫外吸收特征峰及吸收峰高度与zen及载体蛋白均不一样，在二者的基础上发生了叠加及平移，分别在276nm及316nm处出现了吸收，由于人工抗原zen-cat偶联后通过萃取除去了未偶联上的zen，而此处偶联后的人工抗原zen-cat在316nm出现了载体蛋白没有而zen特有的吸收峰，初步证明了zen人工抗原偶联成功。

②、sds-page鉴定人工抗原

紫外吸收光谱只能初步鉴定人工抗原的合成成功，为了进一步证明zen-cat的成功偶联，还需要通过sds-page进行鉴定，结果如图3中（b）所示，其中，泳道1是260μg/ml的cat标品，泳道2和3是合成的zen-cat。结果显示，cat在60kda左右有带，合成的zen-cat的条带弱于cat标品，可能是合成过程中cat的偶联量较少。但是sds-page的结果也能进一步说明zen-cat的偶联是成功的。

③、westernblot鉴定人工抗原

前两种鉴定方法都只是对zen-cat时候偶联成功做了初步的验证，要真正鉴定zen-cat是否偶联成功还需要利用western-blot看zen和cat是否真正完成了偶联。结果如图3中（c）所示，泳道2为cat的标品，泳道3、4、5均为合成的zen-cat，在60kd左右有带，说明zen-cat偶联成功。

实施例3：zen标准曲线的测定

图4、图5为对该可视化检测系统的反应时间及fecl2浓度的优化情况图。采用控制变量法，确定了最佳反应时间为10min，最佳的fecl2浓度为10mmol/l。

将稀释至一定浓度的zen标准品50μl加入到已包被有50μlzen单克隆抗体的反应孔中，随后加入50μl人工抗原zen-cat，混合均匀，盖膜，37℃下反应30min，然后用洗涤液pbst（将5mltween20，4gnacl，1.45gna2hpo4•12h2o，0.1gkcl，0.2gkh2po4溶于双蒸水ddh2o中并定容到1000ml制得）反复洗涤3~4次，拍干，加入溶解于pbs（0.1mol/lph=7.8）的h2o2（45μl，1mol/l），混合均匀，盖膜，37℃下反应10min。随后，加入aunrs（100μl）、fecl2（50μl，10mmol/l）溶液于上述酶标孔中，盖膜，室温下反应10min，加入终止液h2so4（10μl，2m），最后，扫描紫外吸收光谱，并拍照。

图6为与不同浓度的zen反应后的aunrs的紫外吸收光谱图（a）、吸光度与zen浓度之间的线性关系（b）及显色图像（c）。由图中可见，该可视化检测试剂盒在检测zen的线性范围为0.2-4000ng/ml，并且由图6中（c）所示，不同浓度的zen会呈现出浅红色、浅绿色、绿色、浅黄色、黄色等多种颜色，证明其具备很好的显色性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。