含有固定化免疫球蛋白和脂质基抗原的硝化纤维素片材及其用途的制作方法

含有固定化免疫球蛋白和脂质基抗原的硝化纤维素片材及其用途
1.本发明涉及硝化纤维素片材，其包含固定化抗体和脂质基抗原。本发明还涉及一种试剂盒，其包含所述硝化纤维素片材。本发明还涉及所述片材的用途，特别是在检测指示感染的抗体的方法中的用途。
2.绪论
3.许多感染原(例如细菌、病毒和真菌)会产生抗原，这些抗原会引起受感染对象的免疫反应。该免疫反应伴随着针对这些抗原的特异性抗体的产生。因此，这些抗体是感染原(infectious agent)感染的指示。
4.许多抗原暴露在感染原的外表面上或从感染原的外表面排出。一类特别重要的抗原是脂质基抗原(lipid based antigen)，因为许多脂质基抗原能够引发强免疫反应。


技术实现要素：

5.本发明利用由脂质抗原引发的强免疫反应(potent immune response)，用于诊断。具体来说，在本发明中，固定化脂质抗原用于检测源自疑似受感染原感染的对象的样品中的抗体。这样就可以诊断出具有特定感染的对象。
6.感染性疾病的诊断通常涉及复杂、昂贵且耗时的测试，并且通常需要专门的实验室。
7.此外，常规实验室测试(例如，elisa)需要大量抗原，这些抗原的量通常难以纯化或合成。因此，需要提供一种需要较少抗原的测试。
8.此外，常规测试仅诊断对象是否感染了特定感染原，而不能给出感染阶段的指示。
9.本发明旨在解决这些问题。
10.在第一方面中，本发明涉及一种硝化纤维素片材，其包含固定至硝化纤维素片材不同位置的如下物质：免疫球蛋白g；免疫球蛋白m；以及至少一种脂质基抗原，所述抗原能够结合响应于对象体内感染原的感染而产生的抗体。
11.在第二方面中，本发明涉及一种试剂盒，其包括：根据本发明第一方面的硝化纤维素片材，并且还包括：含有具有偶联检测标记物的抗igg二抗的容器；以及含有具有偶联检测标记物的抗igm二抗的容器。
12.在第三方面中，本发明涉及检测指示感染的抗体的方法，其包括：将至少一张如本发明第一方面所述的片材暴露于源自疑似受感染的对象的样品；通过用选自抗igm二抗或抗igg二抗的具有偶联检测标记物的二抗孵育来确定样品中是否存在与固定在片材上的抗原结合的一抗；以及检测二抗与所述一抗的结合，其中所述一抗与固定在片材上的抗原结合，其中，所述一抗与二抗的结合导致阳性信号，其中，用抗igm二抗孵育时的阳性信号表示感染早期，而用抗igg二抗孵育时的阳性信号表示感染后期。
13.在第四方面中，本发明还涉及如第一方面所述的片材的用途，用于区分感染早期和感染后期和/或用于区分活动性和非活动性感染。
14.本发明人发现可以将脂质衍生的抗原和免疫球蛋白固定在同一硝化纤维素片材
上。对脂质抗原的强免疫反应可以获得强检测信号并获得可靠结果。重要的是，将脂质抗原固定在硝化纤维素上仅需要有限量的抗原，这很重要，因为抗原的纯化和合成通常既耗时又昂贵。例如，仅0.2ng的固定化抗原就足以获得良好的信号，而常规技术(例如elisa)需要250μg每96孔板。因此，本发明提供了所需抗原量的重要减少。
15.这些片材易于在检测指示感染的抗体的方法中使用，不需要复杂、昂贵且耗时的测试和专门实验室。在这方面，本发明的试剂盒包括用于实施本发明方法的部件，而无需昂贵且专门的设备和从业者，例如，研究人员将仅需要标准实验室设备。这使得本发明适用于诊断，但也适用于不旨在诊断感染的研究目的。
16.重要的是，本发明还可以确定感染的状态。igm是响应感染对象暴露于来自感染原的抗原而出现的第一种抗体。因此，针对感染原抗原的igm抗体的存在表明这些感染原的感染早期。另一方面，igg抗体是在抗体反应成熟(maturation)后产生的，其主要参与后期二次免疫反应。因此，针对感染原抗原的igg抗体的存在表明这些感染原的感染后期。因此，本发明使得可以在仅使用一种测试基材(即硝化纤维素片材)的简洁测定中确定是存在感染早期还是感染后期。这可以确定针对由感染原引起的感染所产生的免疫球蛋白g(igg)和/或免疫球蛋白m(igm)，并可以在一次单一测定中，通过使用标准实验室设备来确定感染状态。
具体实施方式
17.本发明基于使用硝化纤维素片材提供一种易于使用的检测指示感染的抗体的存在，所述硝化纤维素片材包括固定在其不同(分开)位置处的如下物质：免疫球蛋白g；免疫球蛋白m；和至少一种脂质基抗原，所述抗原能够结合响应于对象体内感染原的感染而产生的抗体。
18.如果这些抗原源自或基于该特定感染原的抗原，则将片材暴露于源自怀疑患有特定感染原感染的对象的样品会导致与固定化抗原结合。这些抗体的结合可以通过使用其上偶联有检测标记物的二抗来进行检测，例如报告酶抗ig偶联物。该偶联物包含检测标记物部分和能够识别与基材上固定化抗原结合的免疫球蛋白(抗体)的部分。换言之，这些偶联物能够识别免疫球蛋白并能够产生可检测信号。如果样品中确实存在针对固定化抗原的一抗，则检测标记物将提供信号，例如如果标记物是报告酶，则由报告酶提供。用抗igm二抗偶联物孵育时的阳性信号表示感染早期，另一方面，用抗igg孵育时的阳性信号表示感染后期。固定在片材上的igg和igm用作阳性/阴性对照。
19.在本发明的上下文中，响应于对象体内感染原的感染而产生的抗体(igg、igm、iga)可被视为一抗，而另一方面，具有偶联检测标记物的抗ig(抗免疫球蛋白)用作二抗部分，其可以与一抗结合。在免疫学领域，一抗和二抗是两类抗体的常见表达，这些抗体根据它们是直接与抗原或蛋白质结合(这些是一抗)还是靶向另一种抗体(一抗)进而又与抗原或蛋白质结合(后面这些抗体是二抗)而分类。
20.允许响应于对象感染产生的抗体与本发明的硝化纤维素片材的固定化抗原结合，因此可以被视为一抗，而抗ig偶联物通过其二抗部分与一抗结合，并通过其检测标记物(例如报告酶部分)提供信号检测和放大。在本发明的上下文中，二抗可以与一抗结合，一抗与固定在硝化纤维素基材上的抗原直接结合。在这方面，抗igm二抗是特异性识别并结合igm
的抗体，抗igg二抗是特异性识别并结合igg的抗体，抗iga二抗是特异性识别并结合iga的抗体。
21.作为解释，在免疫标记过程中，一抗的fab域与固定化抗原结合，并将其fc域暴露于具有检测标记物的二抗。因此，二抗的fab域可以与一抗的fc域结合。由于fc域在同一动物类别中是恒定的(例如在人类类别中)，因此只需要一种类型的二抗就可以与动物类别中的多种类型一抗结合。这允许仅使用一种类型的二抗来检测多种类型的一抗。因此，二抗通常是市售可购得的。此外，多个二抗可以与单个一抗结合，从而提高灵敏度和信号放大。
22.与二抗偶联的检测标记物进而允许对结合进行检测。二抗可与报告酶(如辣根过氧化物酶(hrp)或碱性磷酸酶(ap))；或荧光染料(如荧光素异硫氰酸酯(fitc)、罗丹明衍生物、alexa fluor染料等)；或用于各种应用的其他检测标记物(包括生物素)进行偶联。在该方面，检测标记物可以是报告酶(如辣根过氧化物酶(hrp)或碱性磷酸酶(ap))；或荧光染料(如荧光素异硫氰酸酯(fitc)、罗丹明衍生物、alexa fluor染料等)；或适用于在免疫测定中提供信号的其他分子，如本领域中可获得的那些。
23.在优选实施方式中，二抗是报告酶抗ig偶联物。在该情况下，检测标记物是报告酶。
24.如果使用抗igm偶联物作为二抗进行孵育，则固定在片材上的igm用作阳性对照：抗igm偶联物与固定化igm结合的阳性信号表明测试有效，而抗igm偶联物与固定化igg结合的信号较弱或不存在则表明该信号对与igm结合具有特异性。
25.另一方面，如果使用抗igg偶联物进行孵育，则固定在片材上的igg用作阳性对照：抗igg偶联物与固定化igg结合的阳性信号表明测试有效，而抗igg偶联物与固定化igm结合的信号较弱或不存在则表明该信号对与igg结合具有特异性。
26.如果使用报告酶抗igm偶联物进行孵育，则固定在片材上的igm用作阳性对照：抗igm偶联物与固定化igm结合的阳性信号表明测试有效，而抗igm偶联物与固定化igg结合的信号较弱或不存在则表明该信号对与igm结合具有特异性。
27.另一方面，如果使用报告酶抗igg偶联物进行孵育，则固定在片材上的igg用作阳性对照：抗igg偶联物与固定化igg结合的阳性信号表明测试有效，而抗igg偶联物与固定化igm结合的信号较弱或不存在则表明该信号对与igg结合具有特异性。
28.在一个实施方式中，硝化纤维素片材还可以包含固定至该硝化纤维素片材的免疫球蛋白a。这使得可以进行测试，所述测试用选自抗igm偶联物、抗igg偶联物和抗iga偶联物的二抗进行孵育来确定样品中是否存在与固定在片材上的抗原结合的一抗。具体来说，这些可以选自下组：报告酶抗igm偶联物、报告酶抗igg偶联物和报告酶抗iga偶联物。iga是在粘液分泌物中发现的主要免疫球蛋白，包括来自泌尿生殖道、胃肠道、前列腺和呼吸道上皮的分泌物，例如痰。因此，该实施方式可能特别适合提供附加可能性，用于测试影响粘膜的感染。例如，这对于检测疑似结核病感染的对象尤其有利，因为结核病感染会导致痰中的高抗体浓度。如果在该实施方式中使用抗iga偶联物进行孵育，则在该情况下，固定在片材上的iga用作阳性对照：抗iga偶联物与固定化iga结合的阳性信号表明测试有效，而抗iga偶联物与固定化igm和iga结合的信号较弱或不存在则表明该信号对与iga结合具有特异性。除了基于粘液分泌物的样品的特殊优势外，用于样品中iga抗体的测试还可以通过确认由用于igm和/或igg抗体的其它片材上测试获得的结果来提供进一步的改进。在设想用于iga
抗体的测试的情况下，根据本发明的试剂盒可以进一步包括含有作为二抗的抗iga偶联物(优选报告酶抗iga偶联物)的容器。
29.用于本发明目的的样品可以是任意样品，其可含有针对感染原抗原的抗体。在一个实施方式中，所述样品是血液来源样品。样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。血清是没有凝血因子的血浆，优选作为血浆。因此，本技术中的血浆一词也可以指(血液)血清。血清是优选的，因为它含有比血浆更少的不同物质，这可能导致非特异性相互作用或不需要的生物活性。此外，血清可具有比血浆更低的粘度。因此，使用血清可以避免稀释样品的需要，从而节省时间和材料。在另一个实施方式中，样品可以源自粘液分泌物。在样品是全血样品的情况下，如需要，样品可以预过滤或分离为血浆或血清。用于该预过滤步骤的合适过滤器是0.2微米过滤器。原则上，对于本发明的目的，这样的过滤步骤不是必需的。
30.可能需要在用本发明片材孵育样品之前对样品进行稀释。如果全血样品未充分过滤或如果患者的身体状况需要过滤，则可能需要对全血样品或血浆或血清进行稀释。因此，本技术中的血浆或血清可以还指稀释的血浆或血清。也可能需要对来自粘液分泌物的样品进行稀释。稀释可以用任意合适的稀释剂进行，例如pbs基缓冲剂，例如封闭冲剂(blocking buffer)。任选地，可以向血液/血浆/血清中加入低浓度的去污剂以避免组分粘连。
31.如果需要，样品可以任选地在使用前脱脂，例如通过去除脂肪酸(例如胆固醇)进行脱脂。由于交叉反应，胆固醇可能会产生错误信号。
32.样品来源的对象可以是人或另一种动物。在这方面，本发明适用于医学和兽医目的，并且如上所述，也适用于不旨在诊断感染的研究目的。在合适的实施方式中，样品源自人。在该情况下，二抗是抗人ig偶联物，例如报告酶抗人ig偶联物。在该情况下，二抗识别并结合至人免疫球蛋白(ig)，例如，人igg、igm或iga。
33.所述报告酶抗人偶联物优选选自：辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶(ap)偶联物。在该情况下，检测所述样品中抗体与片材上固定化抗原的结合的步骤包括：使用选自辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶(ap)偶联物的报告酶抗
‑
ig偶联物。这些偶联物是众所周知的用于可视化观察抗体结合的标准偶联物。这些偶联物因其简单、灵敏和广谱应用而通常用作检测探针。辣根过氧化物酶(hrp)和碱性磷酸酶(ap)可用于通过显色、化学发光或荧光输出来检测靶蛋白质。这些读出可以通过技术人员已知的任何方式进行。
34.固定在硝化纤维素片材上的脂质基抗原可以是天然抗原，也可以是由感染原纯化的或基于感染原抗原合成的修饰抗原。在这方面，应理解术语“抗原”包括能够与抗体特异性结合的任何分子，无论其是否天然存在或是否基于此类抗原并合成。
35.固定在硝化纤维素片材上的抗原适合源自感染原(包括细菌、支原体、真菌、寄生虫、原生动物、病毒等)或者如果合成的话则是基于这些抗原。这些感染原将脂质基抗原暴露于对象的免疫系统并引发免疫球蛋白的产生。
36.众所周知的病毒包括：甲型肝炎病毒(hav)、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、丁型肝炎病毒(hdv)、庚型肝炎病毒/gb
‑
c病毒(hgv/gbv
‑
c)、人免疫缺损病毒1型和2型(hiv
‑
1/2)、人类嗜t淋巴细胞病毒i型和ii型(htlv
‑
i/ii)、巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(ebv)、tt病毒(ttv)、人类疱疹病毒6型(hhv
‑
6)、sen病毒(sen
‑
v)和人类细小病毒(hpv
‑
b19)。
37.细菌包括：例如，梅毒螺旋体(treponema pallidum，tp，梅毒病原体)、小肠结肠炎
耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)、葡萄球菌(staphylococcus)和链球菌(streptococcus)属(细菌污染的常见病原体)、伯氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)(莱姆病病原体)假单胞菌属、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhea)、衣原体(chlamydia)(包括肺炎衣原体(c.pneumoniae)、沙眼衣原体(c.trachomatis)、鹦鹉热衣原体(c.psittaci)和畜衣原体(c.pecorum))、螺杆菌(helicobacter)(包括幽门螺杆菌(h.pylori)和猫胃螺杆菌(h.felis))、牙周细菌(periodontal bacteria)(包括牙龈卟啉菌(p.gingivalis)和血卟啉菌(p.sanguis))、分枝杆菌(mycobacteria)(如结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis))等。
38.寄生虫包括例如疟原虫(plasmodium species)(疟疾(malaria))、克氏锥虫(trypanosoma cruzi)(恰加斯氏病(chagas'disease))和微小巴贝虫(babesia microti)(巴贝斯虫病(babesiosis))。
39.真菌包括念珠菌(candida)，酵母样真菌(yeast
‑
like fungi)，如隐球菌(cryptococcus)、毛癣菌(trichophyton)等。
40.特别优选脂质基抗原源自或基于细菌脂质基抗原，因为细菌将许多脂质衍生抗原暴露在其细胞膜上，例如外膜。在这方面，感染可能是由细菌感染原引起的。
41.在优选实施方式中，硝化纤维素片材包含固定于其上的多种不同脂质基抗原，所述抗原能够与响应于对象体内感染原的感染而产生的抗体结合。该多种抗原优选源自或基于相同感染原。换言之，优选多种不同脂质基抗原的脂质基抗原各自能够与响应于相同感染原的感染而产生的抗体结合。在该实施方式中，使用多种不同脂质基抗原(特别是多种不同类型的脂质基抗原)提高了阳性测试结果的可靠性，因为感染引起的抗体存在的假阳性鉴定的风险降低了。
42.或者，多种抗原源自或基于不同感染原。这允许仅使用单个试剂盒来诊断不同感染原的感染。
43.除了在受感染对象的不同感染阶段中不同类型的免疫球蛋白出现的差异之外，感染原在感染不同阶段也可能呈现出不同抗原。因此优选，所述多种不同脂质基抗原中的至少一种所述脂质基抗原能够与指示感染早期的抗体结合，并且至少一种其它所述脂质基抗原抗能够与指示感染后期的抗体结合。其提高了关于感染状态的测试结果的可靠性。此类抗原的实例将在下文中进行更详细地讨论。
44.在优选实施方式中，一种或多种所述抗原源自分枝杆菌脂质基抗原或基于分枝杆菌脂质基抗原。因此，待检测的感染可能是由结核分枝杆菌引起的。
45.结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)是分枝杆菌科的一种致病细菌物质，并且是大多数结核病(tuberculosis，tb)病例的病原体.tb仍然是许多低收入和中等收入国家的主要死亡原因之一。此外，报道了越来越多的多重耐药tb病例。因此，诸如由本发明提供的诊断结核病的可靠且快速的方法是极其重要的。
46.在优选实施方式中，所述分枝杆菌抗原包括分枝杆菌酸衍生抗原，或者其中所述抗原是分枝菌酸衍生抗原，其任选地用官能团修饰以能够固定到硝化纤维素片材上。
47.本技术中提及的分枝菌酸衍生抗原可以源自分枝杆菌，所述分枝杆菌选自剧毒和致病的分枝杆菌。术语“分枝菌酸衍生抗原”(mycolic acid derived antigen)应理解为包含能够与抗分枝菌酸抗体结合的分枝菌酸残基的化合物。优选地，分枝菌酸抗原源自结核
分枝杆菌。所述分枝菌酸衍生抗原可以是选自下组的至少一种：分枝菌酸、索状因子、化学修饰的分枝菌酸、化学修饰的索状因子、合成的分枝菌酸衍生物、合成的索状因子衍生物。
48.分枝菌酸衍生抗原可适当地选自由天然来源获得的分枝菌酸、合成制备的分枝菌酸、含硫分枝菌酸、分枝菌酸的结构类似物和分枝菌酸蜡酯中的一种或多种。分枝菌酸衍生抗原还包括这些衍生物的盐和/或酯。
49.分枝菌酸衍生物的天然来源包括分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)的细胞壁，其包括不同类别化合物和不同分枝菌酸同系物的混合物，通常为结合至细胞壁的衍生物形式。
50.可能优选使用合成制备的分枝菌酸，因为这样可以准确地确定使用特定衍生物的种类以及量。
51.因此，为了能够提供具有高可靠性和可重复性结果的检测，优选使用半合成的或甚至更优选合成的分枝菌酸衍生物，其与天然混合物中发现的单一化合物相同或密切相似。
52.也可以使用分枝菌酸衍生物，例如醇酯(例如一元醇和多元醇)和糖酯。糖酯是特别优选的。糖酯包括具有单糖、双糖或低聚糖的酯。所述糖可合宜地包括基于己糖和/或戊糖的糖单元。葡萄糖酯是这些酯的合适实例。进一步合适的糖酯是海藻糖酯，包括海藻糖单分枝菌酸酯和海藻糖二分枝菌酸酯。例如，索状因子是海藻糖单分枝菌酸酯或海藻糖二分枝菌酸酯，其是已知的合适糖酯实例。这些化合物在自然界中以不同种类的分枝菌酸和不同种类的同系物的复杂混合物形式存在。
53.由于很难确定天然产物中存在的索状因子身份并分离单个分子物质，因此出于本发明的目的，优选使用半合成或更优选使用合成的分枝菌酸衍生物。此外，已知分枝菌酸单元的结构会影响索状因子的生物活性。合适的半合成衍生物包括半合成索状因子，其可以通过使分枝菌酸附着至糖基团来制备。然而，这些半合成的因子仍含有不同同系物的混合物。因此，用于本发明上下文的特别合适的分枝菌酸衍生物是合成的索状因子，例如wo2010/08667中所述合成的索状因子，即式(m)
x
(s)
y
(m')
z
的化合物，其中x为1至6，y为1至12，z为0至10，各m和各m'独立地为分枝菌酸残基，其包括β
‑
羟基酸部分，并且各s为单糖单元。
54.也可以使用分枝菌酸衍生物的盐，例如，铵盐、碱金属盐和碱土金属盐。也可以使用含硫分枝菌酸和/或其酯或盐。这些化合物是含硫的天然分枝菌酸化合物的类似物。分枝菌酸蜡酯包含环丙基基团或烯烃和内酯基团，并且可以从天然来源分离或合成制备。
55.用于本发明检测方法的合适化合物具体见述于wo 2016/024116。
56.合成分枝菌酸的合适实例显示于图1、图2和图3，其任选地用官能团进行修饰以固定在硝化纤维素上。在这方面，本技术还应理解为也描述了使用图1、图2和图3的一种或多种抗原与除硝化纤维素以外的任何基材组合用于诊断结核病。
57.另一合适的分枝杆菌抗原可以是甘露糖基磷酸酮抗原(mannosyl phosphoketide antigen)。该甘露糖基磷酸酮抗原可以是由下式(i)表示的化合物以及其对映异构体、非对映异构体及其混合物：
[0058][0059]
其中y是1至10的整数，x
+
是阳离子或不存在，r是烃基，其中抗原任选地用能够固定至所述硝化纤维素片材的一个或多个官能团进行修饰。在x
+
为阳离子的情况下，优选为质子或金属阳离子，例如na或k阳离子。优选甘露糖基磷酸酮抗原的疏水尾部相当短。这使得抗原更易溶于水溶液，因此更易于使用。由相对短的烃链而导致的亲水性增加使得固定抗原的硝化纤维素表面更亲水。因此，抗原中抗体的相互作用更容易发生，检测速度也将提高。此外，如果使用合成抗原，则抗原更容易合成。在式(i)中，y优选为3至9的整数，优选为4至8的整数，其中，y最优选为5。在式(i)中，r优选为烷基。优选地是，r为c1
‑
c15烷基，优选为c5烷基或c7烷基，优选地，其中r是n
‑
c5
‑
烷基或n
‑
c7
‑
烷基。优选地，r是n
‑
c7
‑
烷基。在式(i)中，y可用一个或多个能够固定到所述硝化纤维素片材上的官能团修饰。作为替代或附加方式，在式(i)中，r可用一个或多个能够固定到所述硝化纤维素片材上的官能团修饰。关于该官能团，优选所述甘露糖基磷酸酮抗原在疏水性尾部末端处具有烯烃或炔烃修饰。优选地，所述甘露糖基磷酸酮抗原是β
‑
甘露糖基磷酸酮(mannosyl phosphomycoketide)，任选地用一个或多个能够固定到所述硝化纤维素片材上的官能团修饰。非常优选的β
‑
甘露糖基磷酸酮是如下物质以及其对映异构体、非对映异构体或混合物：
[0060][0061]
其中x
+
是阳离子(例如，金属阳离子，例如k
+
或na
+
或质子)或不存在，并且r是n
‑
c7h
15
或n
‑
c5h
11
，其任选地用一个或多个能够固定至硝化纤维素片材的官能团进行修饰。非常优选r为n
‑
c7h
15
，因为这是结核分枝杆菌中常见的形式。β
‑
甘露糖基磷酸酯抗原可显著提高结核标志物检测的敏感性。.在源自经测试涂片阳性的患者的样品的情况中，检测到抗体与这些抗原非常高的结核病特异性结合。由于β
‑
甘露糖基磷酸酯分子存在于结核分枝杆菌中，因此可以从细菌中分离出来。在这种情况下，如果需要，可使用天然抗原并对其进行修饰以达到固定目的。分枝杆菌中β
‑
甘露糖基磷酸酯的水平相当低，远低于例如分枝菌酸的水平。因此，更有利的是完全化学合成β
‑
甘露糖基磷酸酯分子或利用生产生物体通过转基因表达合成β
‑
甘露糖基磷酸酯分子。这节省了相当大的成本。因此，优选β
‑
甘露糖基磷酸酯是合成的。例如，合成可以如2006年van summeren等人所述进行。上述定义的甘露糖基磷酸酮抗原在检测涂片阳性者的样品时表现特别好，这些样品具有tb感染后期。因此，甘露糖基磷酸酮抗原是能够结合指示感染后期的抗体的脂质基抗原的实例。
[0062]
另一合适的分枝杆菌抗原可以是二酰基糖脂抗原(diacyl glycolipid antigen)。本技术中的术语“二酰基糖脂抗原”是指如下结构(iii)至(xi)中限定的二酰化
海藻糖结构。这些二酰基糖脂实际上是二酰化海藻糖抗原，并且因此也可以称为二酰化海藻糖抗原或其衍生物，其可以限定为由下式(iii)表示的化合物，
[0063][0064]
其中：r2和r3相同或不同，独立地选自h、so3h、so3‑
或so3‑
/m
+
，其中m
+
是阳离子，优选金属阳离子，例如na
+
或k
+
；r2’
和r3’
相同或不同，为酰基，其中抗原任选地用能够固定至硝化纤维素片材的一个或多个官能团修饰。本文所述的二酰基糖脂还包括式(iii)化合物的对映异构体、非对映异构体和混合物。在式(iii)中，r2’
和r3’
相同或不同，可以是：
[0065][0066]
其中，x独立地选自不饱和或饱和直链或支化烃链，其适当地是烷基，任选地用一个或多个取代基取代和/或用一个或多个官能团修饰。在式(iii)的优选实施方式中，r2是so3‑
、so3h或so3‑
/
m
+
，其中m
+
是阳离子，并且r3是h。优选在r2是so3‑
/
m
+
的情况下，阳离子是na
+
或k
+
。在式(iii)的另一优选实施方式中，r2和r3是h。优选在式(iii)的r2’
和r3’
之一中，x是任选地用一个或多个取代基取代和/或用一个或多个官能团修饰的饱和直链烃链，其中在r2’
和r3’
中的另一个中，x是任选地用一个或多个取代基取代和/或用一个或多个官能团修饰的饱和支化烃链。在该方面，进一步优选地是，在式(iii)中，r2’
和r3之一是下式(iv)表示的基团：
[0067][0068]
其中r4为式c
n
h
n+1
的任选地用一个或多个官能团修饰的直链饱和烃链，其中n为1至20的整数，其中y为1至10的整数，其中r5为h或oh，r2’
和r3’
中的另一个为任选地用一个或多个官能团修饰的式c
n
h
n+1
的直链饱和烃链，其中n是1至20的整数。优选由r2’
和r3’
表示的酰基链相对较短。这使得抗原更易溶于水溶液，因此更易于使用。由相对短的酰基链而导致的亲水性增加使得固定抗原的硝化纤维素更亲水。因此，抗原中抗体的相互作用更容易发生，检
测速度也将提高。此外，如果使用合成抗原，则抗原更容易合成。在这方面，在根据式(iii)的具有短r2’
和r3’
酰基链的抗原中，r4可以是具有任选地用一个或多个官能团修饰的式c
n
h
n+1
的直链饱和烃链，其中n是1至10的整数，例如1至9的整数，例如1至8的整数，例如1至7的整数，例如1至6的整数，例如1至5的整数，例如1至4的整数，例如1至3的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9，其中y是1至10的整数，例如1至5的整数，例如1至4的整数，例如1至3的整数，例如1、2、3、4或5，其任选地用一个或多个官能团进行修饰。在这方面，r2’
和r3’
中的另一个可以是具有任选地用一个或多个官能团修饰的式c
n
h
n+1
的直链饱和烃链，其中n是1至15的整数，例如1至14的整数，例如1至13的整数，例如1至12的整数，例如1至11的整数，例如1至10的整数，例如1至9的整数，例如1至8的整数，例如1至7的整数，例如1至6的整数，例如1至5的整数，例如1至4的整数，例如1至3的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。如果二酰基糖脂抗原存在于结核分枝杆菌(mycobacterium,tuberculosis)中，则其可从结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)中分离。或者，其可以进行合成，例如通过由ep1 950 218a1所示的方法进行合成。如果该抗原在结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)中不存在，则可由从结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)分离的抗原进行修饰或合成。二酰基糖脂可适当地为在结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)中发现的二酰化磺基糖脂(ac2sgl)，其任选地用一个或多个官能团修饰。在优选的实施方式中，所述ac2sgl是2
‑
棕榈酰基
‑3‑
羟基结核烯酰(hydroxyphthioceranoyl)
‑
2'
‑
硫酸盐
‑
α
‑
α
’‑
d
‑
海藻糖或2
‑
硬脂酰基
‑3‑
羟基结核烯酰
‑
2'
‑
硫酸盐
‑
α
‑
α
’‑
d
‑
海藻糖，任选地用一个或多个官能团修饰。ac2sgl分子具有海藻糖2'
‑
硫酸盐/酯核心，并在2
‑
位置用棕榈酸残基或硬脂酸残基二酰化，在3
‑
位置用具有不同长度甲基取代基的羟基结核菌烯醇酸(hydroxyphthioceranic acid)二酰化，例如化合物(vi)：
[0069][0070]
其中，r2是so3‑
、so3h或so3‑
/
m
+
，其中，m
+
是阳离子，优选金属阳离子，优选na
+
或k
+
。其它示例由下式vii、viii和ix表示。
[0071]
[0072][0073]
其中，在式vii、viii和ix中，so3‑
/
na
+
部分也可以是so3‑
、so3h，并且na
+
也可以是另一阳离子，例如k
+
。在另一实施方式中，上述二酰基糖脂抗原可以由式(x)表示：
[0074][0075]
r2'和r3'在上文式(iii)定义的式(x)中。优选地，本文的酰基链之一或两者进行修饰，从而能够固定至硝化纤维素片材。特别优选使用式(xi)所示化合物：
[0076][0077]
其中，对酰基链之一或两者进行修饰，从而能够固定至硝化纤维素片材。式(xi)化合物的酰基链可以取代式(iv)中限定的任何链，并且该链可以任选进行修饰以使其能够固定到硝化纤维素。
[0078]
合适的修饰包括在其中一个酰基链上加入硫代基团或在其中一个酰基链的末端并入不饱和键，例如双键。关于用于固定目的的官能团，优选所述甘露糖基磷酸酮在疏水性
尾部末端处具有烯烃或炔烃修饰。
[0079]
此类改性分子的合适示例包括根据式(xii)的化合物，其在一个酰基链的末端处具有烯烃基团；或式(xiii)的化合物，其在一个酰基链的末端处具有巯基。
[0080][0081]
式(xii)和(xiii)化合物的烷基链可替代具有用上述烯烃或巯基修饰的式c
n
h
n+1
或式(iv)的任何链。二酰基糖脂抗原提供了一种获得对结核标志物的高灵敏度检测的手段。在源自经测试涂片阴性的患者的样品的情况中，检测到抗体与这些抗原非常高的结核病特异性结合，即，其为感染早期。因此，所述甘露糖基磷酸酮抗原是能够结合指示感染早期的抗体的脂质基抗原的实例。
[0082]
另外，可以用作固定化抗原的脂质基抗原是结核菌素腺苷抗原(tuberculosinyl adenosine antigen)。这些结核菌素腺苷抗原是下式(xiv)所示化合物及其对映异构体、非对映异构体及混合物，
[0083][0084]
其中，在式(xiv)中，r1是h，或具有式(xv)的基团，
[0085][0086]
r2不存在或是具有式(xv)的基团，前提是r1和r2之一是具有式(xv)的基团，r3和r4独立选自：氢、oh、酰基链、包含酰基链的羧酸基、其任意组合，其中，所述抗原任选地用能团
能够固定到硝化纤维素片材上的一个或多个官能团进行修饰。在该式中，优选r4为oh，更优选r4和r3为oh。在式(xiv)中，r1可以是式(xv)的基团，而r2可以不存在。在另一实施方式中，r1可以是h，而r2可以是式(xv)的基团。在r2是式(xv)的基团的情况中，其所连接的氮带有正电荷。能够固定至硝基纤维素片材的官能团优选包括在式(iii)的基团中。在r3或r4是酰基或包含酰基的情况下，优选r3和r4中只有一个是酰基或包含酰基，或特别是脂肪酸基团。酰基优选具有合适长度和疏水性，从而能够固定到硝化纤维素片材上。酰基链可以用官能团进行修饰，从而能够固定至硝化纤维素片材。酰基链可以是如wo2014/210327中所述的分枝菌酸链。优选的是，如果式(xiv)的抗原具有酰基链，则酰基链相当短。这使得抗原更易溶于水溶液，因此更易于使用。由相对短的烃链而导致的亲水性增加使得固定抗原的检测表面或传感器表面更亲水。因此，抗原中抗体的相互作用更容易发生，检测速度也将提高。此外，如果使用合成抗原，则抗原更容易合成。在这方面，在具有短酰基链的抗原中，酰基链可以是直链或支化c1‑
c
20
链，例如c5‑
c
20
链。在优选的实施方式中，式(xiv)抗原由式(xvi)或式(xvii)化合物表示，其任选地用能够固定至硝化纤维素片材的一个或多个官能团进行修饰。例如，该官能团可以是叠氮基团，其反过来可用于偶联反应以偶联生物素基团。
[0087][0088]
优选地，根据式(xiv)的抗原选自下组：1
‑
结核菌素基腺苷(如式(xvi))、1
‑
结核菌素基
‑
2'
‑
脱氧腺苷(1
‑
tuberculosinyl
‑2’‑
deoxyadenosine)、1
‑
结核菌素基
‑
o
‑
乙酰基腺苷(1
‑
tuberculosinyl
‑
o
‑
acetyladenosine)或其组合。这些化合物天然存在于结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)中，并可从中分离出来。在这种情况下，如果需要，可使用天然抗原并对其进行修饰以达到固定目的。分枝杆菌中这些化合物的水平相当低，远低于例如分枝菌酸的水平。因此，更有利的是化学合成这些分子，或在生产宿主微生物中合成它们，然后进行分离和任选的进一步纯化步骤。这节省了相当大的成本。因此，优选这些化合物是合成的。例如，可根据2016年buter等人所述的方法合成式(xiv)的合成抗原。
[0089]
这些结核菌素腺苷衍生合成抗原也可以由下式(xvii)表示以及所述抗原的对应异构体、非对应异构体：
[0090][0091]
其中，在式(i)中，r1是h，或具有式(xv)的基团，
[0092][0093]
r2不存在或是具有式(xv)的基团，前提是r1和r2之一是具有式(xv)的基团，r3和r4独立选自：氢、oh、酰基、其任意组合，其中r5是连接基团，其中所述抗原通过所述连接基团固定到所述硝化纤维素片材上。在式(xviii)中，r1可以是式(xv)的基团，而r2可以不存在。在另一实施方式中，r1可以是h，而r2可以是式(xv)的基团。在r2是式(xv)的基团的情况中，其所连接的氮带有正电荷。在r3或r4是酰基的情况下，优选r3和r4中只有一个是酰基。例如，r3或r4可以是酰胺、酯、酮或醛或羧酸基团。可以r3是h且r4是oh。也可以r4是h且r3是oh。还可以r3和r4是h。优选地，r3和r4之一是oh，例如，r4是oh，或者r3是oh。优选地，r4为oh，更优选r4和r3为oh。此类分子可根据2016年buter等人所述的方法高效合成，并显示出良好的抗原呈递。式(xviii)抗原可适当地由式(xix)或(xx)化合物表示，其中r5为连接基团：
[0094][0095]
关于式xviii、xix和xx的抗原的r5的连接基团，适用于将抗原固定到硝化纤维素基材的任何连接基团均可以是合格的，并且许多适合抗原固定的连接基团是本领域已知的。下面将讨论此类连接部的示例。为了能够固定至硝化纤维素，连接部优选包含能够固定至基材的官能团。因此，本技术中的术语“官能团”应理解为能够将抗原固定到硝化纤维素上的基团。为此目的，所述连接基团可包含选自下组的官能团：硫基、胺基、醛基、叠氮基、多
组氨酸或生物素基团。用于本发明目的的合适连接部是适当官能化以实现固定化的聚乙二醇(peg连接部)。在优选实施方式中，所述连接基团是含有能够固定至硝化纤维素基材的官能团的peg(丙二醇)。许多合适的peg连接部是可用的，并且有许多方法适合将抗原偶联到固体硝化纤维素基材上。例如，peg基团可包含用基团官能化，所述基团包括选自下组的官能团：硫基、胺基、醛基、叠氮基、多组氨酸或生物素基团。在一个实施方式中，连接基团因此可以是生物素化peg基材。在另一实施方式中，所述连接基团可以是peg基团，其含有叠氮基，例如，显示为下式(xxi)中。
[0096][0097]
在检测结核标志物的方法中使用上述限定的结核菌素腺苷抗原，检测到抗体与这些抗原的高度结核特异性结合。与使用固定化分枝杆菌抗原(mycolic antigen)相比，源自结核病实际标志物的信号被背景信号遮挡的程度显著降低，因此源自结核病实际标志物的信号变得更加明显。以此方式，本发明提供了对结核标志物检测敏感性的显著提高。发明人进一步发现，如果在检测结核标志物的方法中使用了如上限定的结核菌素腺苷抗原，并结合了能够与指示人或动物中存在分枝杆菌物质的抗体结合的其他类型抗原，则能够提供关于样品来源对象患有活动性肺结核的更可靠指标。发明人现在发现，从接种卡介苗的对象或从结核病感染治愈的对象获得的样品中，不能正确检测到上述定义的针对结核菌素腺苷抗原的抗体。换言之，如果样品中含有可测量数量的上述定义的针对结核菌素腺苷抗原的抗体，则表明存在活动性结核病。这使得可以在结核病测试中区分具有活动性结核病的对象和其中感染无活动性的对象之间。
[0098]
在优选实施方式中，本发明的硝化纤维素片材包含多种不同脂质基抗原，所述多种不同脂质基抗原包括如下物质中的两种或更多种：
[0099]
a)至少一种分枝菌酸衍生抗原；
[0100]
b)至少一种结核菌素腺苷抗原；
[0101]
c)至少一种二酰基糖脂抗原；
[0102]
d)至少一种甘露糖基磷酸酮抗原。这些抗原的示例如上所述。
[0103]
更优选地，所述多种不同脂质基抗原包括：
[0104]
a)至少一种分枝菌酸衍生抗原；
[0105]
b)至少一种结核菌素腺苷抗原；
[0106]
c)至少一种二酰基糖脂抗原；以及
[0107]
d)至少一种甘露糖基磷酸酮抗原，因为如上所述，针对这些类型抗原中每一种抗原的抗体的存在可以提供关于来自测试样品对象的分枝杆菌感染状态或阶段的特定信息。
这些抗原的示例如上所述。
[0108]
硝化纤维素片材还可以包含固定于其上的一种或多种蛋白质抗原，所述蛋白质基抗原能够与响应于对象体内感染原的感染而产生的抗体结合。优选地，固定至硝化纤维素的脂质基抗原和蛋白质抗原各自能够与响应于相同感染原的感染而产生的抗体结合。这进一步提高了用硝化纤维素片材进行测试的可靠性。在细菌感染的情况下，此类蛋白质抗原可选自特定感染原的任何已知蛋白质抗原。例如，如果感染原是结核分枝杆菌，则用于此目的的可能蛋白质抗原可包括但不限于选自下组的分枝杆菌蛋白质抗原：结核分枝杆菌(m.tuberculosis)mpt51、mpt63、mpt64、mpt53，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)85
‑
a蛋白质，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)85
‑
b蛋白质，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)85
‑
c蛋白质，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)cfp
‑
10蛋白质，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)cfp10/esat6嵌合蛋白质(chimera protein)，结核分枝杆菌(m.tuberculosis)esat
‑
6、rv3881c、rv0934(psts1)、rv0932c(psts2)和rv3006(lppz)等。该蛋白质可以是重组蛋白质。
[0109]
脂质衍生抗原和免疫球蛋白、以及任选的蛋白质衍生抗原可首先固定至硝化纤维素片材，然后将该片材切割成多个片状物(sheet)或盘状物(disc)。这确保了抗原和免疫球蛋白的均匀分布。在这方面，硝化纤维素片材可以是任何合适的形式，例如试条或片状物。
[0110]
固定化至硝化纤维素可通过本领域已知的任何常规方法进行。发明人已观察到，脂质衍生抗原可通过抗原的一个或两个疏水碳链(例如酰基链)与硝化纤维素的疏水性相互作用来固定。还可以在疏水性尾部末端处用官能团(例如烯烃或炔烃)来修饰抗原。这些机制还包括硫醇化抗原与环氧化物官能化硝酸纤维素膜的共价连接，通过硝酸纤维素结合链霉抗生物素蛋白锚定蛋白的生物素化抗原的连接，以及通过环氧化物硫醇键使用官能化硝酸纤维素膜固定的抗原与新型硝酸纤维素结合锚蛋白的融合，用于直接偶联和共价连接。
[0111]
根据本发明，还提供了试剂盒，其包括上述硝化纤维素片材，并且还包括：含有具有偶联检测标记物的抗igg二抗的容器；
[0112]
以及含有具有偶联检测标记物的抗igm二抗的容器。任选地，试剂盒还包括含有具有偶联检测标记物的抗iga二抗的容器。
[0113]
在优选实施方式中，提供了试剂盒，其包括上述硝化纤维素片材，并且还包括：含有报告酶抗igg偶联物的容器；
[0114]
以及含有报告酶抗igm偶联物的容器。任选地，其还含有报告酶抗iga偶联物。报告酶用于在实施本发明的方法时，确定所述样品中存在与固定在片材上的抗原结合的抗体。
[0115]
尽管研究实验室中可提供其他试剂、容器和设备，但试剂盒的优选实施方式可进一步包括：孵育托盘，构造为接收多个所述片材，具有样品稀释剂的容器；具有洗涤缓冲剂的容器；具有偶联物稀释剂的容器；和具有报告酶检测基材的容器。上述孵育托盘允许同时对于多个所述片材进行测试。试剂盒还可以设置有使用说明。
[0116]
以下实施例旨在对本发明的原理进行说明，不应解释为限制权利要求的范围。
[0117]
实施例
[0118]
实施例1
–
示例性硝化纤维素片材
[0119]
一种硝化纤维素试条，其上具有固定至硝化纤维素试条的如下物质：iga、igm和
igg，结核(tb)脂质抗原，其包括4种不同的分枝菌酸衍生抗原(包括自然变体)；1种合成结核菌素腺苷抗原；2种不同的二酰基糖脂抗原；和2种甘露糖基磷酸酮抗原(包括天然变体)。天然变体通过其疏水尾部的疏水相互作用固定在硝化纤维素上。合成变体用生物素进行修饰，以改进对硝化纤维素的固定。每种抗原以0.2ng的量包含在片材上。
[0120]
实施例2：示例性试剂盒
[0121]
下表1公开了包含实施例1的硝化纤维素试条的试剂盒。
[0122][0123]
表1：示例性试剂盒的内含物
[0124]
使用前，优选将所有试剂置于室温(20
‑
25℃)下1小时。抗igg和抗iga在1/2000稀释度下使用(在20ml偶联物稀释剂中的10μl偶联物)。抗igm在1/4000稀释度下使用(在20ml偶联物稀释剂中的5μl偶联物)。
[0125]
下表2列出了使用试剂盒所需的其他材料，但其未包含在试剂盒中。
[0126][0127]
表2：未包含试剂盒中的材料。
[0128]
实施例3：试剂盒的使用
[0129]
该试剂盒可根据以下方案使用：
[0130]
1.允许所有试剂和样品在20
‑
25℃的室温下放置1小时。
[0131]
2.该试剂盒含有抗igg、抗igm或抗iga的浓缩偶联物。通过将5(igm)或10(igg/iga)μl偶联物添加到20ml偶联物稀释剂中对偶联物进行稀释。或者，在分析多达8个试样时，可将2.5μl添加到10ml偶联物稀释剂中。使用后立即将未稀释的偶联物储存在2
‑
8℃下。对小瓶进行标记，表明已添加偶联物。(也可在步骤9后准备)
[0132]
3.用镊子从存储管中取出所需数量的片材。
[0133]
4.将片材放入8孔孵育托盘中，使黑色标记线朝上并位于片材左侧。
[0134]
5.向培养皿的每个孔中添加1ml封闭样品稀释剂(例如，封闭剂可以是洗涤剂和酪蛋白的组合：不含烃、不含脂肪酸；来自surmodics的酪蛋白；来自surmodics的牛奶封闭剂；kem和tec；大豆蛋白水解物；bsa：不含脂肪酸，其中洗涤剂可以是例如tween 20、tween 80、triton x100；pluronics 125；chaps；np
‑
40)
[0135]
1.将盖子放在托盘上，并在20
‑
25℃的摇床上封闭托盘中的印记30分钟。
[0136]
2.将去脂或不去脂的血清或血浆样品混合：在盖上盖子通过涡流进行移液之前，不要通过移液进行均质，以防止气溶胶形成。
[0137]
3.用移液管将2.5μl样品移入带有样品稀释剂(稀释400倍)的单个孵育托盘中的液体中。
[0138]
4.将盖子放在托盘上，并在20
‑
25℃的摇床上孵育托盘30分钟。
[0139]
5.优选用真空抽吸器或移液管从托盘中取出液体。
[0140]
6.向托盘中添加1ml洗涤缓冲剂，并摇动孵育30秒。
[0141]
7.重复步骤10和11 2次。
[0142]
8.优选用真空抽吸器或移液管从托盘中取出所有液体。
[0143]
9.向托盘孔中添加1ml稀释偶联物。
[0144]
10.将盖子放在托盘上，并在20
‑
25℃的摇床上孵育托盘30分钟。
[0145]
11.优选用真空抽吸器或移液管从托盘中取出液体。
[0146]
12.向托盘中添加1ml洗涤缓冲剂，并摇动孵育30秒。
[0147]
13.重复步骤16和17 2次。
[0148]
14.用移液管从托盘中取出所有液体。
[0149]
15.向托盘孔中添加1ml基材溶液。
[0150]
16.在20
‑
25下，在摇床上孵育10分钟。.
[0151]
17.优选用真空抽吸器或移液管从托盘中取出基材溶液。
[0152]
18.向孔中添加1ml洗涤缓冲剂。
[0153]
19.在摇床上孵育2分钟。.
[0154]
20.优选用真空抽吸器或移液管从托盘中取出液体。
[0155]
21.取出片材并在玻璃表面上干燥。
[0156]
22.干燥后，将片材施加至打印分析表上。(提供有关准备分析表格的说明)。
[0157]
23.使用epson v600扫描仪600dpi扫描纸张。
[0158]
24.使用分析软件对扫描进行分析。(提供数据分析说明)。