专利名称：促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
细胞外基质(ECM)包括胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性 蛋白，通过维持细胞存活、决定细胞形状、调节细胞增殖、控制细胞分化并参与细胞 迁移来保持组织功能正常，维持新陈代谢旺盛，从而保持机体的年轻状态。成纤维细 胞参与了多种细胞外基质成分分泌的过程，包括胶原蛋白、粘连蛋白、透明质酸、硫 酸软骨素、硫酸皮肤素及弹性蛋白等的分泌调控。
成纤维细胞也是皮肤真皮中的主体细胞成分，其分泌的胶原纤维、弹性纤维及基 质成分与成纤维细胞一同组成了皮肤真皮的主体，大量研究表明，成纤维细胞生物学 特性的改变直接影响着皮肤的状态。由胶原蛋白作为固体支架、透明质酸填充其中形 成了具有一定张力，富有弹性且含水量稳定的结构从而维持组织平衡。但随着年龄的 增长皮肤逐渐衰老，皮肤中胶原蛋白(I型、III型)的含量逐渐下降，透明质酸流失， 导致皮肤松弛、干燥、弹性下降、支撑性变差出现皱纹。同时，衰老的皮肤中存在大 量游离的自由基，破坏细胞膜，失活蛋白并通过损伤基因导致细胞变异。
目前，大多数研究是单一的针对成纤维细胞分泌某种ECM成分进行的，例如， 法国La Roch-Posey实验室研究人员曾指出外部应用维生素C可增加皮肤胶原蛋白的 数量并促进胶原蛋白的连接。但在单一水平上增加细胞分泌的某种基质成分并不能很 好的保持细胞外基质的平衡并改善细胞外基质的状态，对于如何同时增加ECM复合 成分的分泌还没有很深入的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂及其制备 方法与应用。
本发明提供的一种促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，包括组分A)、 组分B)和组分C);
其中，组分A)为禽蛋的蛋清，组分B)为蛋清溶菌酶，组分C)为丙酮酸或丙 酮酸盐。
4当然，上述促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂可只包含上述三种组分，
即该促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂由组分A)、组分B)和组分C)组 成；其中，组分A)为禽蛋的蛋清，组分B)为蛋清溶菌酶，组分C)为丙酮酸或丙 酮酸盐。
上述促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂中，禽蛋的蛋清可为全蛋清成分 (含未知活性因子)或经分离纯化的各个组分(如卵转铁蛋白或葡萄糖)中的一种或 其任意比例的混合组分。组分A)禽蛋的蛋清的质量份数为0.75-4，组分B)蛋清溶 菌酶的质量份数为15-400，组分C)丙酮酸或丙酮酸盐的质量份数为0.2-5。该制剂中 还可包含组分D)卵转铁蛋白和组分E);其中，组分D)的质量份数为0.1-0.5，组 分E)的葡萄糖的质量份数为0.1-0.5。该制剂中，组分A)禽蛋优选为鸡蛋，丙酮酸 盐优选为丙酮酸钠。该制剂可优先促进成纤维细胞的细胞外基质成分中透明质酸合成 酶、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白中的任意一种或其任意比例的混合物的分泌。
本发明提供的制备上述促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂的方法，是将 组分A)禽蛋的蛋清，组分B)蛋清溶菌酶，组分C)丙酮酸或丙酮酸盐混合均匀， 得到本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂。
上述制备方法中，还可添加卵转铁蛋白和/或葡萄糖。各物质的用量同上所述。
另外，含有本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂的皮肤外用 膏剂，也属于本发明的保护范围。该制剂中，促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的 制剂占皮肤外用膏剂总质量的5%-25%。
本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，成分简单易得，成本 低廉，可明显刺激皮肤成纤维细胞中I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和透明质酸合成酶 的分泌，且不影响透明质酸酶的合成，因而可减少透明质酸的降解作用，维持ECM 的平衡促进新陈代谢，有利于改善细胞生境，从而改善皮肤的弹性与保水特性，保持 机体尤其是皮肤的年轻状态。另外，溶菌酶是天然的防腐剂，具有较好的刺激细胞生 长、减少凋亡、抑制或杀死微生物等作用，可减少或省去制剂中抗生素或防腐剂的添 加，提高了生物安全性。该制剂还可同其他对动物(含人)机体无害的成分相组合， 促进毛囊发育，改善毛发生长状况，预防与治疗发毛稀疏等疾病。该制剂是一种适用 于皮肤保健的生物制品，适合于哺乳动物(如鼠、猪、人类等)。该制剂来源于生物 提取技术，无有害物质残留，使用安全、高效，不同于现有的促进成纤维细胞ECM 单一成分分泌的方法，具有多重效果，适用范围广，可用于皮肤替代物的制备、抗衰 老保养品制作、美容品及医学治疗等领域，具有广阔的应用前景。
图1为本发明实施例5中涂有本发明提供的制剂的小鼠皮肤切片的HE染色结果。 图2为本发明实施例6中涂有本发明提供的制剂的小鼠皮肤切片的HE染色结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。 实施例1、促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂的制备及RT-PCR检测 取新鲜鸡蛋(白来航、寿光或白洛克均可)的蛋清于4'C静置过夜，4000r/min离 心10min取上清2mg，按照体积比1: 10用超纯水进行稀释，并添加200mg/ml的蛋 清溶菌酶和20mg/ml的丙酮酸钠，混匀后得到本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞 外基质成分的制剂。
取胎龄14.5天的昆明白小鼠，去四肢、内脏，取背部皮肤，剪碎。 600U/ml胶原蛋白酶与400U/ml透明质酸酶4'C浸泡过夜，37'C消化lh，过200 目细胞筛得到小鼠皮肤成纤维细胞悬液，DMEM培养基，添加10%胎牛血清，传代纯 化后，培养基中添加10%上述制备方法得到的制剂作为制剂组；对照组中，培养液为 DMEM培养基，添加10%胎牛血清，每天更换培养液。
RT-PCR检测上述皮肤成纤维细胞Co/"a7 (III型胶原蛋白)、Co/7/a7 (I型胶 原蛋白)、/fya〃 (透明质酸酶)、i/w/ (透明质酸合成酶)mRNA的相对表达量(内 参为P-actin)，其结果分别列于表1一表4中。其中，表l-表4中相对表达量为目的 基因表达量与内参表达量的灰度值之比。表5为RT-PCR检测Col 13 a 1 、 Col 11 a 1 、 Hyal 1 、 Hasl所用的引物列表。
表1 RT-PCR检测皮肤成纤维细胞Co/WW (胶原蛋白)mRNA相对表达量
制剂组 对照组
18小日寸 0.803653255± 0.424013434±
0.043071636b 0.0789048943
24小时 1.064774236± 0.397848624±
0.042407516b 0.0350597853
表2 RT-PCR检测皮肤成纤维细胞Co/〃。7 (胶原蛋白)mRNA相对表达量
制剂组 对照组
18小时 2.889711± 0J34663士
0.173962b 0.02702a
624小时 1.99761± L510531士
0.205682b 0.047412a
表3 RT-PCR检测皮肤成纤维细胞/fya/7 (透明质酸酶)mRNA相对表达量
制剂组对照组
18小时1.6077296±1.13026777±
0.11010315130.15487730T
24小时0.8432089U0.86446105±
0.056080093a0.128124797a
表4 RT-PCR检测皮肤成纤维细胞/fe7 (透明质酸合成酶)mRNA相对表达量
制剂组 对照组
18小时0.26756384±0.16041669±
0.009853093b0.023276856a
24小时0.23860卯08±0.14572553±
0.056684347b0.008075008a
注同一时间内，标不同字母为差异显著，相同字母为差异不显著
表5 RT-PCR检测Coll3al、 Colllal、 Hyall、 Hasl所用的引物
p-actin GCCCAGAGCAAGAGAGGTATC ACCAGAGGCATACAGGGACAG 267
Collal TTGCTTCCCAGATGTCCTATG CACCATCCAAACCACTGAAG 348
Col3al TGCTGGAAAGAATGGGGAGAC CACCAGAATCACCCTTGCCTC 215
Hasl GTCCAAATCTTACTTCCGAG TAGTTAGCAGCCAGTTTCTTC 363
Hyall AACTTTAGTGGAGGCAGCAG TACTGGGGTAAAGGGCATAG 245
由上述列表可知，本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂可促
进ECM (包括Co〃^/ (胶原蛋白III型)、Co/7/W (胶原蛋白I型)和if，〃 (透
明质酸酶))的分泌，能够改善皮肤的弹性与保水特性，保持皮肤的年轻状态。
U (上游引物)
L (下游引物)
片段长度实施例2、促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂的制备及该制剂对小鼠皮
肤成纤维细胞中羟脯氨酸含量的影响
取新鲜鸡蛋(白来航、寿光或白洛克均可)的蛋清于4"C静置过夜，4000r/min离 心10min取上清4mg，按照体积比1: 10用超纯水进行稀释，并添加400mg/ml的蛋 清溶菌酶和5mg/ml的丙酮酸钠，混匀后得到本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞 外基质成分的制剂。
取胎龄14.5天的昆明白小鼠，去四肢、内脏，取背部皮肤，剪碎。 600U/ml胶原蛋白酶与400U/ml透明质酸酶4。C浸泡过夜，37。C消化lh，过200 目细胞筛，得到小鼠皮肤成纤维细胞悬液，DMEM培养基，添加10%胎牛血清，传代 纯化后，培养基中添加25%上述制备方法得到的制剂，作为制剂组；对照组中，培养 液为DMEM培养基，添加10%胎牛血清，每天更换培养液。于培养12小时、24小时 后，分光光度计检测培养液中羟脯氨酸(胶原蛋白特有氨基酸)含量，间接测定胶原 蛋白含量，结果如表6所示。
_表6制剂组和对照组对小鼠皮肤成纤维细胞中羟脯氨酸含量的影响
羟脯氨酸含量_制剂组 对照组
12小时 8.0732
±0.6453
24小时 11.4065 _±0.9857
注同一时间内，标不同字母为差异显著，相同字母为差异不显著。
实施例3、促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂的制备及该制剂对人皮肤 成纤维细胞中羟脯氨酸含量的影响
取新鲜鸡蛋(白来航、寿光或白洛克均可)，取蛋清4'C静置过夜，4000r/min离 心10min取上清0.75mg，按照体积比1: IO用超纯水进行稀释，并添加15mg/ml的蛋 清溶菌酶和0.2mg/ml的丙酮酸钠，混匀后得到本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞 外基质成分的制剂。
人皮肤成纤维细胞的培养DMEM培养基，添加10%胎牛血清，培养基中添加 5%上述制备方法得到的制剂，作为制剂组；对照组中，培养液为DMEM培养基，添 加10%胎牛血清，每天更换培养液。于培养12小时、24小时后，检测培养液中羟脯 氨酸含量，结果如表7所示。
表7制剂组和对照组对人皮肤成纤维细胞中羟脯氨酸含量的影响
6.6016 ±0.5077
10.5041 ±1.2276
8羟脯氨酸含量_制剂组 对照组
12小时 6.9802
±0.4278
24小时 11.5448 _±1.3141
注同一时间内，标不同字母为差异显著，相同字母为差异不显著。 实施例4、制备皮肤外用膏剂及该外用膏剂的效果检测
将外用膏剂(该外用膏剂中各组分的名称及质量百分含量分别为凡士林70%、
水25%、乳化剂失水山梨醇脂肪酸酯4.5%、尼泊金乙酯0.5%)中添加本发明实施例 l制备得到的制剂，该制剂的质量百分浓度为5%，分别涂抹于去毛的小鼠背部皮肤表 面，2次/日，连续使用20天以上，该外用膏剂对小鼠皮肤水分的影响结果列于表8 中，可知本发明提供的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂能够提高皮肤的保 水特性。
_表8本发明提供的皮肤外用膏剂对小鼠皮肤水分的影响
水 正常鼠 衰老鼠
分-
值 制剂组 对照组 制剂组 对照组
49.33 47.33 49.00 48.00
_^
水 正常鼠 衰老鼠
分-
值 制剂组 对照组 制剂组 对照组
39.83 38.04 38.50 37.19
6.6016 ±0.5077
10.5041 ±1.2276
实施例5、制备皮肤外用膏剂
将外用膏剂(该外用膏剂中各组分的名称及质量百分含量分别为凡士林75%、 水20%、乳化剂失水山梨醇脂肪酸酯4.8%、尼泊金乙酯0.2%)添加本发明实施例1 制备得到的制剂，该制剂的质量百分浓度为15%，分别涂抹于去毛的小鼠背部皮肤表面，2次/日，连续使用20天以上后，将小鼠处死，取使用制剂部位皮肤，制备皮肤 切片，进行HE染色，观察皮肤结构变化，如图1所示。其中，制剂组为经过上述步 骤得到的皮肤切片，如图la所示；对照组为未涂抹本发明提供的皮肤外用膏剂的小鼠 背部皮肤切片，如图lb所示。由图1可知，制剂组小鼠皮肤较对照组相比，结构紧 凑，胶原填充紧密。
实施例6、制备皮肤外用膏剂
将外用膏剂(该外用膏剂中各组分的名称及质量百分含量分别为凡士林80%、 水15%、乳化剂失水山梨醇脂肪酸酯4.7%、尼泊金乙酯0.3%)中添加本发明实施例 l制备得到的制剂，该制剂的质量百分浓度为25%，分别涂抹于去毛的小鼠去毛背部 皮肤表面，2次/日，连续使用20天以上后，将小鼠处死，取使用制剂部位皮肤，制 备皮肤切片，进行HE染色，观察皮肤结构变化，如图2所示。其中，制剂组为经过 上述步骤得到的皮肤切片，如图2a所示；对照组为未涂抹本发明提供的皮肤外用膏剂 的小鼠背部皮肤切片，如图2b所示。由图2可知，制剂组小鼠皮肤较对照组相比， 结构紧凑，胶原填充紧密。序列表
<110>北京中科颐诺生物技术有限公司
<120>促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂及其制备方法
<130> CGGNAM81593
<160> 10
<210> 1
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gcccagagca agagaggtat c
<210> 2
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
3ccagaggca tacagggaca g<210> 3<211> 21<212> DNA <213>人工序列<220><223><400> 3ttgcttccca gatgtcctat g<210> 4<211> 20<212> DNA <213>人工序列<220><223><400> 4caccatccaa accactgaag<210> 5<211> 21<212> DNA <213>人工序列<220><223>
<400> 5
tgctggaaag aatggggaga c 2〗
<210> 6
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>
<400> 6
caccagaatc acccttgcct c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>
<400> 7
gtccaaatct tacttccgag 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
13<213〉人工序列<220> <223> <400> 8tagttagcag ccagtttctt c<210> 9<211> 20<212> DNA <213>人工序列<220><223><400> 9aactttagtg gaggcagcag<210> 10<211> 20<212〉 DNA <213>人工序列<220><223><400> 10 tactggggta aagggcatag说明书第11/11页212020
权利要求
1、一种促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，包括组分A)、组分B)和组分C)；其中，所述组分A)为禽蛋的蛋清，组分B)为蛋清溶菌酶，组分C)为丙酮酸或丙酮酸盐。
2、 根据权利要求1所述的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，其特征在于所述促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂由组分A)、组分B)和组分C)组成；其中，所述组分A)为禽蛋的蛋清，组分B)为蛋清溶菌酶，组分C)为丙酮酸或丙酮酸盐。
3、 根据权利要求1或2所述的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，其特征在于所述促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂中，组分A)禽蛋的蛋清的质量份数为0.75-4，组分B)蛋清溶菌酶的质量份数为15-400，组分C)丙酮酸或丙酮酸盐的质量份数为0.2-5。
4、 根据权利要求1-3任一所述的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，其特征在于所述促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂中，还包括组分D)卵转铁蛋白和/或组分E)葡萄糖；所述组分D)卵转铁蛋白的质量份数为0.1-0.5，组分E)葡萄糖的质量份数为0.1-0.5。
5、 根据权利要求l-3任一所述的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂，其特征在于所述禽蛋为鸡蛋，所述丙酮酸盐为丙酮酸钠；所述细胞外基质成分为透明质酸合成酶、I型胶原蛋白和III型胶原蛋白中的任意一种或其任意比例的混合物。
6、 一种制备权利要求1-5任一所述的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂的方法，是将下述组分A)、组分B)和组分C)混合均匀，得到所述促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂；其中，所述组分A)为禽蛋的蛋清，组分B)为蛋清溶菌酶，组分C)为丙酮酸或丙酮酸盐。
7、 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述禽蛋的蛋清的质量份数为0.75-4，蛋清溶菌酶的质量份数为15-400，丙酮酸或丙酮酸盐的质量份数为0.2-5。
8、 根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述将禽蛋的蛋清、蛋清溶菌酶和丙酮酸或丙酮酸盐混合步骤前，还加入组分D)卵转铁蛋白和/或组分E)葡萄糖；所述组分D)卵转铁蛋白的质量份数为0.1-0.5，组分E)葡萄糖的质量份数为0.1-0.5。
9、 一种含有权利要求1-5任一所述的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂的皮肤外用膏剂。
10、 根据权利要求9所述的皮肤外用膏剂，其特征在于所述皮肤外用膏剂中，权利要求1-5任一所述的促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂占所述皮肤外用膏剂总质量的5%-25%。
全文摘要
本发明公开了一种促进成纤维细胞分泌细胞外基质成分的制剂及其制备方法与应用。该制剂包括组分A)禽蛋的蛋清，组分B)蛋清溶菌酶，组分C)丙酮酸或丙酮酸盐，还可包括卵转铁蛋白和/或葡萄糖。将上述组分混合均匀，即得到该制剂。该制剂可作为一种皮肤外用膏剂进行应用。本发明提供的制剂可明显刺激皮肤成纤维细胞中胶原蛋白和透明质酸合成酶的分泌，提高皮肤的弹性与含水量。该制剂来源于生物提取技术，无有害物质残留，使用安全、高效，不同于现有的促进成纤维细胞ECM单一成分分泌的方法，具有多重效果，适用范围广，可用于皮肤替代物的制备、抗衰老保养品制作、美容品及医学治疗等领域，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K38/43GK101648010SQ20081011835
公开日2010年2月17日 申请日期2008年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者坤 于, 想 李, 连正兴, 韩红兵 申请人:北京中科颐诺生物技术有限公司