一种人工表皮化妆品检测试剂盒的制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种人工表皮化妆品检测试剂盒的制备方法及其应用，属于细胞培养领域。

背景技术：

随着社会的发展和现代人们生活水平的提高，越来越多的人更加关注自身的外在形象，并且希望自己能以美好形象出现在各种活动场合下以增加自信，与此同时人们更加追求皮肤的健康，所以更多的人希望以健康的皮肤和美好的形象展现自身对高端生活的追求。因此，各种功效类化妆品一直是人们所追求的，并且化妆品的市场占有率越来越大，而且品牌种类日益增多。那么，面对市面上琳琅满目的化妆品产品，消费者如何判断产品的抗衰老、抗氧化和美白功效及其对皮肤的刺激性、腐蚀性伤害就成为一个值得关注的问题。

传统的化妆品检测是利用家兔体内眼刺激法，实验动物作为人类的替身为人类的科学发展起到了不可替代的作用，随着科学技术的发展，特别是生命科学研究领域实验动物使用数量的猛增，实验动物的痛苦及其权利引起了社会公众的极大关注。优化替代检测方案有计算机模拟分析、牛眼混浊通透性实验、离体的兔眼实验、离体的鸡眼实验和鸡胚绒毛尿囊膜实验等。但面对动物伦理和人种属性差异的挑战，russell和burch提出了3r原则。自1959年russell和burch提出动物实验的减少、替代和优化(reduction，replacement，andrefinement，3r)理论以来，特别是近20年，不再以动物模式为基础的毒理学系统已成为生物医学重要发展方向，并被政府和研究机构所接受。一些动物实验替代方法成为关系国际贸易的技术壁垒。欧洲替代法验证中心在2007年5月发布的“人皮肤模型用于体外皮肤刺激试验的技术标准”指南，以及在2008年11月发布的“两项体外皮肤刺激试验验证方法”声明中，均已表明组织工程皮肤可作为体外皮肤刺激试验的替代模型。因此在实验室条件下构建可用于皮肤刺激试验的组织工程皮肤模型可有效解决这些问题。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种人工表皮化妆品检测试剂盒的制备方法及其应用。本发明在聚碳酸酯膜支架材料上增加人皮肤组织细胞：人成纤维细胞和表皮细胞，制备具有真皮层和表皮层结构的人工表皮。本发明制备的人工表皮化妆品检测试剂盒可应用于化妆品相关功效的检测。

一种人工表皮化妆品检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)取人皮肤组织原始样本分离获得原代皮肤细胞，所述原代皮肤细胞分别经过真皮细胞培养基和表皮细胞培养基选择性培养后可获得人皮肤成纤维细胞和人皮肤表皮细胞；

(2)将步骤(1)中获得的人皮肤成纤维细胞进行传代培养，传代到p3代，获得p3代人皮肤成纤维细胞悬液；

(3)将步骤(1)中获得的人皮肤表皮细胞进行传代培养，传代到p3代，获得p3代人皮肤表皮细胞悬液；

(4)取带聚碳酸酯膜的小室置于六孔细胞培养板中，小室使用coatingmatrix预处理，取步骤(2)制备的p3代人皮肤成纤维细胞悬液100-500μl和ⅰ型胶原蛋白混合，加入上述预处理后的小室中，混合后胶原蛋白终浓度0.8mg/ml，35-37℃培养箱中静置20-60min，静置后，在上述小室内外部加真皮培养基，35-37℃培养箱中培养2-3天，弃掉真皮培养基，培养的真皮层渗液2-3次，获得装有人工皮肤真皮层的小室；

(5)取步骤(3)获得的人皮肤表皮细胞悬液100-500μl加到步骤(4)获得的装有人工皮肤真皮层的小室内，35-37℃培养箱中静置20-60min，静置后在小室内外部加表皮培养基，35-37℃培养箱中培养2-3天进行表皮层培养，弃掉表皮培养基，更换人工表皮培养基，35-37℃培养箱中培养5-10天，每天换液，培养结束后弃去培养基，转移至24孔培养板中，孔底加入固体保存培养基保存，封板、包装后放入2-4℃保存。

进一步的，上述步骤(2)中所述的p3代人皮肤成纤维细胞悬液的细胞浓度40-400万/ml；步骤(3)中所述的p3代人皮肤表皮细胞悬液的细胞浓度40-1000万/ml。

进一步的，上述步骤(4)中所述的真皮培养基为含1-100μmrockinhibitor的真皮细胞培养基，上述真皮细胞培养基(专利号为201610473348.1)包含如下组分：以500ml计，250mldmem高糖培养基、250mlf12营养培养基混合，5-20mlb27添加剂、5-20mlpc-1添加剂、10-100μl基因重组人表皮生长因子、5ml青链霉素；

所述的表皮培养基(专利号为201610473310.4)包含如下组分：以500ml计，角质无血清培养基250ml，dmem培养基125ml，ham’sf-12培养基125ml，200mml-谷氨酰胺：终浓度1.5mm，牛垂体提取物：终浓度25μg/ml，表皮生长因子：终浓度0.2ng/ml，干细胞生长因子：终浓度30ng/ml，纤维母细胞生长因子1.5ng/ml，转化生长因子-β：终浓度0.8ng/ml，血管内皮生长因子：终浓度10ng/ml,100x青霉酸-链霉素：终浓度1x，0.3m氯化钙溶液：终浓度0.4mm；；

所述的人工表皮培养基包含如下组分：30-60％dmem基础培养基，30-60％f12基础培养基，0.1％-4％谷氨酰胺，0.1％-4％腺嘌呤，0.1％-4％氯化钙，0.05％-2％氢化可的松。

进一步的，上述步骤(5)中所述的固体保存培养基为添加0.3％-0.6琼脂的上述人工表皮培养基。

按照上述制备方法制备的人工表皮化妆品检测试剂盒。

上述人工表皮化妆品检测试剂盒在检测化妆品对人皮肤效果方面的应用。

进一步的，上述化妆品对人皮肤效果指化妆品对人皮肤的刺激性、腐蚀性、抗衰老性、抗氧化、美白功效。

进一步的，上述人工表皮化妆品检测试剂盒在检测化妆品对人皮肤刺激性、腐蚀性、抗衰老性、抗氧化、美白功效的方法，包括如下步骤：

s1将小室转移至新的六孔细胞培养板中，每孔外加入人工表皮培养基，置于35-37℃细胞培养箱中孵育4-18h；

s2孵育后，向孵育的小室中加入待测化妆品后室温作用3-30min，终止作用；

s3将步骤s2处理过的小室转移到新的含有人工表皮培养基的六孔细胞培养板中，置于35-37℃细胞培养箱中孵育46-50h；

s4将经过步骤s3孵育后的小室转移到新的24孔细胞培养板中，利用不同染色方法可验证化妆品对皮肤的刺激性、腐蚀性、抗衰老性、抗氧化、美白功效的效果。

进一步的，上述步骤s2中所述的待测化妆品为固体化妆品或液体化妆品，固体化妆品检测用量为0.1-5g，液体化妆品检测用量为10-500μl。

进一步的，上述步骤s4中所述的不同染色方法为：mtt直接染色法、不同培养时间使用mtt染色后活细胞数量比对法、银染色法。

有益效果：

(1)待相关样品作用于化妆品检测试剂盒的人工表皮后我们利用不同的染色检测方式可以验证化妆品或相关化学药品对皮肤的不同功效，可以实现化妆品对人皮肤的刺激性、腐蚀性、抗衰老性、抗氧化、美白功效的效果检测。

(2)制备人工表皮所用的小室为聚碳酸酯膜小室，在浸没培养时，内外室间可以通过膜上的孔进行物质交换；当需要气液面培养时，可减小培养液体积，使培养液与人工表皮底部接触为其生产提供营养。

(3)i型胶原蛋白是组织分布最广泛的胶原，其高级结构为2条α链和1条β链相互缠绕形成右手螺旋结构，三股螺旋分子的有序聚集使胶原纤维具有一定的强度和韧性，其对皮肤弹性的贡献最高。我们的人工表皮以i型胶原蛋白作为支架材料，其可以成胶后形成三维结构，人工表皮的成纤维细胞可以在胶原的三维空间不断增殖，形成由胶原蛋白骨架和真皮成纤维细胞组成的真皮层结构；表皮细胞接种在真皮层上，通过生长、增殖和分化，向上不断分化出多层表皮细胞，表皮细胞经过气液面培养过程，暴露在空气中，不断分化成角质层，其他细胞保持表皮细胞的特性，由此可以形成类似于人类皮肤的人工表皮。

(4)本专利提供的人工表皮接近于正常皮肤，在移植之后能够产生皮肤附属器官如毛囊汗腺等，形成完整的功能性皮肤，且其制备方法简单，周期短。

附图说明

图1化妆品检测试剂盒培养装置图示。

图2化妆品检测试剂盒培养过程外观示意图。

图3化妆品检测试剂盒小室样品检测效果对比。

图4人工表皮石蜡切片结构组成。

图5两种样品检测后人工表皮石蜡切片结构组成对比分析图。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1化妆品检测试剂盒的制备

一、制作方法

1、人皮肤细胞的分离：利用人皮肤组织原始样本分离获得人的原代皮肤细胞。

(1)拿到人皮肤组织原始样本进入实验室，在超净工作台中将组织放入10cm细胞培养皿中，用无菌镊子和剪刀小心去除组织皮下脂肪(脂肪存留厚度不超过1mm)。

(2)在新的10cm细胞培养皿中将皮肤表皮朝下，真皮朝上置于75％酒精浸泡3-10min，然后用含2×庆大霉素的pbs(磷酸盐缓冲液)浸泡2次，3-10min/次，以达到灭菌消毒的目的，称重并记录。

(3)用2把一次性无菌手术刀90度交叉将组织切成糜状，无肉眼可见的颗粒。

(4)将切碎的皮肤组织小心转入含混合酶液(1-3mg/mlcollagenase和1-3mg/mldispase)的离心管中，充分混匀，37℃水浴80rpm震荡消化，消化过程中每隔5-15min摇晃离心管以将组织团块摇散。消化完全时，离心管内不应有大的组织块，且成透亮的组织匀浆状。

(5)胰酶消化：将0.25％胰酶加入含组织的离心管中充分混匀，使其终浓度为0.01-0.1％继续消化10-30min。

(6)dna酶消化：最后再加入10mg/ml的dnase，100-500μl，充分混匀后消化5-10min。

(7)中和酶液终止消化：向离心管中加入相同体积的含有2-15％血替的dmem中和酶消化液，反复吹打20-50次以终止消化作用。

(8)细胞过滤：将100μm细胞过滤器置于50ml离心管上，将消化好的细胞悬液加入过滤系统。

(9)将过滤后的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清。得到的细胞沉淀即为分离得到的皮肤原代细胞。

2、人皮肤成纤维细胞的原代及传代培养：

(1)皮肤原代细胞沉淀用10-40ml含1×庆大霉素的dmem培养基重悬，将细胞团块吹散，进行细胞计数。

(2)取相应数量的皮肤原代细胞悬液至一个新的50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。

(3)原代成纤维细胞用真皮培养基培养，7ml/皿，200-800万/皿，置于37℃培养箱中培养，记为dp0代。

(4)待原代成纤维细胞密度达到80％时，需对细胞进行传代培养，每传1代，代次加1。

(5)旧培养基的清除：将培养皿中旧的真皮培养基清除。

(6)清洗：用pbs(5-10ml)清洗一次，去除残留的旧培养基。

(7)酶消化：加入gibco公司的trypleexpress(1×)，2ml/皿，于37℃培养箱中消化3-8min。

(8)中和：消化时间结束后，显微镜下观察，待细胞全部脱落，加含5-15％血替的dmem终止消化，吹打混匀，将细胞转移至50ml离心管中。

(9)细胞收集：将离心管中的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀用10-40ml含1×庆大霉素的dmem重悬，吹打混匀。用计数板或细胞计数仪计数。根据需要进行细胞传代或冻存。

(10)人成纤维细胞的传代：取相应数量的成纤维细胞悬液至一个新的50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，用适量的真皮培养基重悬成纤维细胞，8ml/t75，120-200万/t75，置于37℃培养箱中培养。

3、人皮肤表皮细胞的原代及传代培养：

(1)取相应数量的皮肤原代细胞悬液至一个新的50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。

(2)细胞培养皿用coatingmatrix预处理，室温静置10min，将多余液体弃掉。

(3)加含1-100μmrockinhibitor的真皮培养基重悬细胞沉淀，7ml/皿，200-800万/皿，置于37℃培养箱中培养，记为ep0代，培养3天后换表皮细胞培养基。

(4)待原代表皮细胞密度达到80％时，需对细胞进行传代培养，每传1代，代次加1。

(5)旧培养基的清除：将培养皿中旧的表皮培养基清除。

(6)清洗：用pbs(5-10ml)清洗一次，去除残留的旧培养基。

(7)酶消化：加入gibco公司的trypleexpress(1×)，2ml/皿，于37℃培养箱中消化8-15min。

(8)中和：消化时间结束后，显微镜下观察，待细胞全部脱落，加含5-15％血替的dmem终止消化，吹打混匀，将细胞转移至50ml离心管中。

(9)细胞收集：将离心管中的细胞悬液1000rpm离心5min，弃上清。细胞沉淀用10-40ml含1×庆大霉素的dmem重悬，吹打混匀。用计数板或细胞计数仪计数。根据需要进行细胞传代或冻存。

(10)人表皮细胞的传代：取相应数量的表皮细胞悬液至一个新的50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，用适量的表皮培养基重悬表皮细胞，8ml/t75，120-200万/t75，置于37℃培养箱中培养。

4、人工表皮模型的制备与培养：

(1)取直径为9mm的带聚碳酸酯膜的小室置于六孔细胞培养板中，小室内外用200-1000μlcoatingmatrix预处理，37℃静置30-60min，将多余液体弃掉。上述小室为图2所示中间部位的圆形小装置，此装置是独立存在的，可以移动、可取出。

(2)人工表皮真皮层制备：ⅰ型胶原蛋白浓度范围在0.05-1.50mg/ml，p3代的人皮肤成纤维细胞浓度范围在40-400万/ml，将胶原蛋白与人皮肤成纤维细胞混合均匀后小心加入小室中，100-500μl/孔，避免有气泡出现，置于37℃培养箱中静置凝胶20-60min。

(3)待真皮层凝胶后，小室内外加真皮培养基进行真皮层培养，小室内培养基用量：100-500μl，小室外培养基用量：3000-6000μl，置于37℃培养箱中培养2-3天。

(4)人工表皮表皮层制备：真皮层培养结束后，弃掉真皮培养基，真皮层渗液2-3次，10-20min/次，将细胞浓度为400-1000万/ml的p3代人皮肤表皮细胞均匀加至人工表皮真皮层上方，构建均匀的表皮层，100-500μl/孔，避免有气泡出现，置于37℃培养箱中静置贴附20-60min。

(5)待表皮层制备好后，小室内外加表皮培养基进行表皮层培养，小室内培养基用量：100-500μl，小室外培养基用量：3000-6000μl，置于37℃培养箱中培养2-3天。

(6)人工表皮角质化培养：人工表皮表皮层培养结束后，弃掉表皮培养基，更换人工表皮培养基，只在小室外加人工表皮培养基，使其人工表皮分化出角质层结构。小室外培养基用量：1000-3000μl，置于37℃培养箱中培养5-10天，每天换液。

(7)人工表皮培养结束后，弃去旧培养基，转移至24孔细胞培养板中，孔底加200-1000μl固体保存培养基保存，封板，包装，4℃保存。

二、结果

如图1所示，图1中a为角质层(包含表皮细胞分化出的角质形成细胞)；图中的b为表皮层(由表皮细胞形成的表皮层)；图中的c为真皮层(细胞胶原蛋白层，即真皮层，由胶原凝胶及数层真皮成纤维细胞构成，整批真皮成纤维细胞在胶原中呈现三维立体生长模式)；图中的d为聚碳酸酯膜；图中的e为培养基；图中的f为人工表皮小室。图4是人工表皮石蜡切片结构组成，可见人工表皮构建好以后的结构。人工表皮石蜡切片结构组成如图4所示。

如图2所示为化妆品检测试剂盒培养过程外观，结构较好的人工表皮在最后培养阶段可以观察到皮肤表面干燥光滑不渗液。挑选结构良好的人工表皮小室保存、封板、包装，可以作为产品用于化妆品或其他化学品检测模型应用。

上述的小室底部是一层聚碳酸酯膜，该膜之上是培养的人工表皮，本发明检测盒即为装有人工表皮的小室。图2里六孔板并不是本发明检测盒的一部分，只是培养时用到，下述的12孔板或24孔板也是容纳小室的容器。

实施例2化妆品检测试剂盒检测试验样品对皮肤效果的实验

一、检测步骤

所选取的试验样品共5种，分别为：无刺激性的pbs缓冲液、无刺激性的萘乙酸固体、化妆品媄因滋皮肤修复原液、无水乙醇和刺激性物质5％sds。

每个样品3个平行，共需要15个人工表皮小室。

(1)拆开化妆品检测试剂盒包装，将小室转移至新的六孔细胞培养板中，每孔外加入500-1000μl人工表皮培养基，置于37℃细胞培养箱中孵育15h。

(2)孵育结束后，向人工表皮小室内加入需检测样品，室温作用15min，固体样品用量为0.2mg，滴加液体化妆品的量为20μl。

(3)待检测样品作用时间结束后，用无菌镊子将小室转移至无菌吸水纸上，用无菌棉签小心吸去小室内的样品，之后用无菌pbs反复冲洗小室内外20次，以终止样品作用。

(4)清洗小室结束后，用无菌棉签将小室内外多余液体吸干，将小室转移至新的含有1000μl人工表皮培养基的六孔细胞培养板中，置于37℃细胞培养箱中培养48h，每天换液。

(5)培养结束后，弃去旧的培养基，用无菌pbs清洗小室内外2次。

(6)用无菌镊子将小室转移至新的24孔细胞培养板中，向24孔细胞培养板中加入500μl浓度为1mg/ml的mtt染液，小室内滴加少许。将24孔细胞培养板置于37℃细胞培养箱中染色3h。

(7)mtt染色结束后，弃去多余mtt染液，用无菌pbs清洗小室内外2次，染色结果如图4所示。

(8)向带有小室的24孔细胞培养板中加入1000μl二甲基亚砜(dmso)溶解蓝紫色结晶甲瓒，小室内滴加少许。将24孔细胞培养板置于摇床上低速振荡15min。

(9)将溶解下的结晶转入96孔板中，200μl/孔，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值。5种样品平均od570nm分别为1.756、1.755、1.756、0.801和0.052。

二、结果分析

如图3所示，根据其检测结果可以分析出，阴性对照磷酸盐缓冲液pbs、固体粉末萘乙酸和化妆品媄因滋皮肤修复液对人工表皮无刺激性伤害，而无水乙醇和刺激物质5％sds对人工表皮有不同程度的损伤，进而可以检测出这些样品对皮肤的伤害与否。

在上述步骤(6)中可以利用不同染色方法可验证化妆品对皮肤的不同效果。利用直接mtt染色法检测活细胞数量，可获得化妆品对皮肤刺激性、腐蚀性的结果，与对照相比，化妆品作用于人工表皮后，mtt染色着色越深越均匀说明化妆品对皮肤的刺激性和腐蚀性越弱或无刺激性和腐蚀性；利用化妆品作用于人工表皮后，将小室的人工表皮培养不同时间点后做mtt染色法检测活细胞数量，可获得化妆品对皮肤的抗衰老功效，与对照相比，化妆品作用后活细胞数量减少程度越低说明化妆品对皮肤的抗衰老功效越好；利用银染法检测人工表皮中黑色素颗粒含量，可获得化妆品对皮肤的美白功效，与对照相比，化妆品作用后人工表皮中黑色素颗粒含量越低说明化妆品对皮肤的美白功效越好。

实施例3.化妆品检测试剂盒检测功效验证

为进一步说明化妆品检测试剂盒的检测功效，我们将进行样品检测之后的人工表皮进行石蜡切片，显微镜观察分析其结构组成。其操作步骤如下：

(1)取样：选取两个做过样品检测的人工表皮小室(检测样品：pbs和无水乙醇)，pbs清洗两遍，用手术刀小心将人工表皮组织沿小室边缘切下。

(2)固定：将组织分别放入小白盒，铅笔标记，4％多聚甲醛过夜固定，用量以盖过样本组织为宜。

(3)流水冲洗：流水冲洗1h。

(4)脱水：纯水5min→50％乙醇1h→70％1h→80％8h→95％1h→95％1h→100％1h→100％1h至完全脱水。

(5)二甲苯透明：此步开始之前应将包埋机提前打开，通常将组织直接放入纯二甲苯中，在通风橱中操作。一般停留时间在1h，直至组织变色为琥珀状透明色。

(6)包埋：石蜡在62℃温度下融化，将透明好的样本放入融化的石蜡箱里1h，取出放入第二个石蜡箱里1h。如若来不及做，可以一直放在石蜡箱里。取出少量液态石蜡滴入包埋盒里，将组织按照要求放入包埋盒，继续加液态石蜡直至加满。放置冷却台冷却。

(7)切片：石蜡切片厚度一般为3～5μm。展片→烤片(60℃12h)。

(8)石蜡切片常温保存，然后he染色。

(9)二甲苯透明脱蜡，5min/次，2次。

(10)除二甲苯：无水乙醇→无水乙醇→95％乙醇→80％乙醇→75％乙醇分别3min

(11)固定：4％多聚甲醛固定10min(湿盒，平放)

(12)水洗2s→苏木精染色(室温)45s→水洗10s→1％盐酸乙醇3s(分化)→水洗5s→促蓝液返蓝10s→水洗15s→0.5％署红液染色45s→水洗2s。

(13)脱水：75％乙醇2s→80％乙醇2s→95％乙醇2s→无水乙醇2s→无水乙醇2s。

(14)透明：二甲苯2s→二甲苯2s或更长等待封片。

(15)中性树胶封片，晾干，镜下观察。

观察结果如图5所示：无水乙醇对人工表皮具有一定的刺激性伤害，对皮肤结构具有一定的破坏性，导致其皮肤组织结构组成遭到破坏。由此可以推测出，化妆品或其他样品中如果含有对皮肤有破坏性的成分，可导致皮肤结构组成发生破坏，我们利用此人工表皮化妆品检测试剂盒可以很好的对相关化妆品等的合格与否做出检测。

另外我们也可以检测化妆品对皮肤的美白功效，检测步骤同刺激性检测，验证时利用银染法染色人工表皮中黑色素颗粒的存在情况，黑色素颗粒减少说明化妆品具有相应的美白功效。同理利用其它相关染色检验方式可以发现本发明所制备的检测试剂盒可以有效检测产品对皮肤的多种效果。