水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法及试剂盒与流程

本发明属于水产品中孔雀石绿残留物检测
技术领域：
，具体涉及水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法及试剂盒。
背景技术：
：孔雀石绿(malachitegreen)又名碱性绿，是一种三苯甲烷类化工染料，曾被用作驱虫剂和杀菌剂治疗水产品水霉病、腮霉病和小瓜虫病等，以及用于环境消毒、池塘暂养和活鱼运输等过程。孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿(leucomalachitegreen)在生物体内消除缓慢、残留时间长，且具有致癌、致畸和致突变等毒副作用，破坏生物体生殖及免疫系统，尤其是隐色孔雀石绿，其毒性更大。因此，包括欧美、中国在内的许多国家都将其列为水产养殖禁用药物。虽然国内违规使用孔雀石绿的现象已得到较好控制，但由于其价格低廉和效果显著，仍有少数渔民在非法使用，在水产行业中，孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留限量标准为1μg/kg，二者总量超过1μg/kg即视为药残超标的问题水产品。目前，检测孔雀石绿及隐色孔雀石绿的方法主要有免疫分析法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法和液相色谱-质谱法、薄层色谱法、电化学检测法、胶体金快速检测试剂板法等，国内测定孔雀石绿及隐色孔雀石绿的标准方法有gb/t19857-2005、gb/t20361-2006和sn/t1768-2006等。免疫分析法需要先通过化学方法设计合成半抗原，再进一步与载体蛋白结合获得具有免疫性的完全抗原，用于真实样品的检测存在假阳性的问题，阳性样品还需进一步确证；气相色谱-质谱法仅可以测定具有挥发性质的隐色孔雀石绿；表面增强拉曼光谱法适用于定性及半定量的快速测定；薄层色谱法不能做到孔雀石绿和隐色孔雀石绿同时检测，且灵敏度较低，一般不用作残留检测，仅作定性分析；电化学检测法受复杂基质干扰等因素影响，尚没有成功应用到动物样品的检测中；胶体金快速检测试剂板法是一种现场快速筛查法。gb/t19857-2005中的液相色谱法需要柱后衍生，紫外-可见光检测器测定，检出限为2μg/kg；gb/t20361-2006中的液相色谱法将孔雀石绿转变为隐色孔雀石绿，荧光法测定，只能测隐色孔雀石绿，可见，液相色谱法尚不能满足日常监管工作的残留限量标准要求。液相色谱-质谱法灵敏度及准确度高，检出限可达0.5μg/kg，常被用作水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的确证方法。申请号为201910746154.8的中国专利公开了一种水产品中孔雀石绿的残留检测方法，该发明采用自制的固相萃取柱(主要填料为壳聚糖、硅藻土、活性炭和碳纳米管)，对振荡提取后的样品溶液进行吸附净化，再将待测物洗脱，收集洗脱液氮吹浓缩，用乙腈和乙酸铵溶解残渣，过滤膜，制得上机的待测液，供液相色谱-质谱仪检测。申请号为201810060294.5的中国专利公开了一种检测水产品中孔雀石绿、结晶紫(crystalviolet)及其代谢产物的前处理方法，该发明依然采用传统的前处理步骤，包括待检样品均质、离心、固相萃取柱的活化、上样、洗脱、过滤膜等步骤，制得上机的待测液，前处理繁琐而耗时。在目前众多液相色谱-质谱法中，普遍存在前处理操作过程耗时较长的缺点。技术实现要素：针对上述不足，本发明公开了一种水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法及试剂盒，显著地减少样品前处理步骤，使操作更为简单，大幅度提高工作效率，实现大批量样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的快速定量分析。本发明是采用如下技术方案实现的：水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法，其包括以下步骤：(1)混合标准溶液的配制：取孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的孔雀石绿标准储备液，取隐色孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的隐色孔雀石绿标准储备液，然后分别取孔雀石绿标准储备液和隐色孔雀石绿标准储备液各20μl于同一个20ml的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至20ml，得到混合标准溶液；(2)混合内标标准溶液的配制：分别取浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液和浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液于同一个容量瓶中，然后用乙腈稀释定容得到混合内标标准溶液，并置于-18℃下避光保存；(3)混合标准工作溶液的配制：取不同体积的混合标准溶液于不同的容量瓶中，接着每个容量瓶中加入混合内标标准溶液，然后用提取剂b稀释定容，配制成一系列浓度梯度的混合标准工作溶液，每个浓度梯度的混合标准工作液中氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿的浓度均位于混合标准工作溶液的浓度梯度范围内；所述提取剂b为酸化乙腈；(4)提取剂a的配制：用重蒸馏水溶解无水乙酸铵配制得到摩尔浓度为2.5mol/l的乙酸铵溶液作为提取剂a；(5)提取：取水产品可食部位绞碎后制成样品，称取2.00g～5.00g样品于50ml离心管中，加入5～10ml提取剂c，混匀，再加入提取剂b，所述提取剂b和提取剂c的添加量之和为15～25ml，先均质，然后再超声提取或者振荡提取10～15min；所述提取剂c是取提取剂a，用去离子水稀释，然后分别等体积加入氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液，再用去离子水定容得到提取剂c；所述提取剂c中各组分的配比可以根据以下式(1)、式(2)和式(3)联合计算得到：vb+vc＝vd(2)式(1)、(2)、(3)中，v1为氘代孔雀石绿标准溶液或氘代隐色孔雀石绿标准溶液的添加体积，单位为ml；v2为提取剂c定容后的体积，单位为ml；v3为提取剂a的添加体积，单位为ml；vb为步骤(5)中提取剂b的添加体积，单位为ml；vc为步骤(5)中提取剂c的添加体积，单位为ml；200为氘代孔雀石绿标准溶液或氘代隐色孔雀石绿标准溶液的浓度，单位为μg/ml；c1为混合标准工作溶液中的氘代孔雀石绿或氘代隐色孔雀石绿的浓度，单位为μg/ml；vd为步骤(5)中添加的提取剂c和提取剂b的体积之和；500为提取剂c定容后的体积与提取剂a的添加体积的比值；(6)净化：将经过步骤(5)处理后的离心管置于离心机中，在转速为2000～8000r/min的条件下离心5～10min，然后取上清液经微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液；(7)测定：使用液相色谱-串联质谱仪分别测定待测样品溶液和一系列浓度梯度的混合标准工作溶液，以孔雀石绿的峰面积与氘代孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中孔雀石绿的浓度，以隐色孔雀石绿的峰面积与氘代隐色孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，隐色孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中隐色孔雀石绿的浓度，然后再按照如下式(4)计算得到样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，计算结果需扣除空白值，式(4)中，x为样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，单位为μg/kg；c为待测样品溶液中孔雀石绿或隐色孔雀石绿的浓度，单位为ng/ml；v为待测样品溶液的测定体积，单位为ml；m为样品的质量，单位为g。进一步的，所述提取剂b为酸化乙腈，其具体是按照无水甲酸与乙腈为1:999的体积比将无水甲酸和乙腈混合得到的。使用上述比例配置的酸化乙腈作为提取剂b使得提取在弱酸性条件下进行，有利于待测样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的提取。进一步的，所述孔雀石绿标准物质和隐色孔雀石绿标准物质的纯度均大于98％。进一步的，所述氘代孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液；所述氘代隐色孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代隐色孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液。进一步的，步骤(7)中使用液相色谱-串联质谱仪测定的流动相是由流动相a和流动相b组成；流动相b为乙腈，流动相a的配制具体是移取提取剂a于容量瓶中，然后加入无水甲酸，再用去离子水稀释定容得到流动相a，定容后所得到的流动相a与提取剂a的体积比为500:1，并且含有体积分数为0.1％的甲酸。流动相中添加加甲酸可以提高质子化效率，使峰形变好。进一步的，步骤(7)中使用液相色谱-串联质谱仪测定时流速为0.2ml/min。进一步的，在步骤(3)中用流动相替换提取剂b进行稀释定容，在所述流动相中，流动相a与流动相b的体积比为20:80。水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析试剂盒，其包括上述的混合标准溶液、氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液、提取剂a、提取剂b。本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：1.本发明利用同位素内标，设计配制提取剂a、提取剂b用于样品的提取和净化，再将提取液经过滤器直接过滤至进样瓶中即可上机检测，可极为显著地减少样品前处理步骤，减少多步操作带来的药物损失，使检测结果更为准确，使操作更为简单，大幅度提高工作效率，而且回收率高、重现性好，实现大批量样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的快速定量分析。2.本发明方法将前处理后的样品在一定的色谱和质谱条件下测定待测样品溶液和混合标准工作溶液，其设定条件包括保护柱、色谱柱、流动相、流速、柱温、进样量、离子源、扫描方式、雾化气、辅助加热气、碰撞气、喷雾电压、碰撞能、监测离子对、透镜电压等，并且以谱峰面积按内标法定量，孔雀石绿以氘代孔雀石绿为内标物计算，隐色孔雀石绿以氘代隐色孔雀石绿为内标物计算，所得到的检测结果准确性高，其中本发明根据孔雀石绿和隐色孔雀石绿的化学性质，选择esi正离子模式，用流动注射进样方式，通过全扫描进行一级质谱分析，得到孔雀石绿和隐色孔雀石绿及其对应内标物质的准分子离子，对准分子离子以srm扫描模式进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，进一步优化碰撞能、透镜电压、喷雾电压、离子传输管温度、蒸发温度、碰撞气压力、鞘气流速、辅助气流速等参数，使各目标物的响应最大化，找出响应值最强的子离子作为定量离子，响应值次强的离子作为定性离子；同时本发明采用乙腈和5mmol/l乙酸铵+0.1％(体积分数)甲酸缓冲溶液为流动相，所述流动相中，有机相采用乙腈，可获得更强的反相洗脱能力及更小的基线噪音，使梯度洗脱程序的设计更加灵活性；水相使用低浓度乙酸铵，并加入甲酸，在esi正离子模式下，可以使孔雀石绿和隐色孔雀石绿及其内标物质在测试时成为离子状态，便于在电喷雾过程中从溶液中转移至气相，使气相离子的生成过程更容易完成，增强离子化效率，从而提高检测灵敏度，改善色谱峰形；采用0.2ml/min的流速，易产生细雾滴，有利于产生气相离子，提高信号强度，优化梯度洗脱程序，使各待测物之间达到较佳的分离效率。3.本发明方法可以直接检测水产品中残留的孔雀石绿和隐色孔雀石绿含量，不需要将孔雀石绿转化成隐色孔雀石再进行含量检测，减少了样品的处理步骤，也避免孔雀石绿和隐色孔雀石绿在样品处理过程中流失，造成检测误差偏大，检测重现性差等问题。附图说明图1是梯度浓度为0.5ng/ml的混合标准工作溶液的选择离子流图。图2是对比例中现有检测方法与本发明方法的样品前处理流程对比图。具体实施方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1：水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法，其包括以下步骤：(1)混合标准溶液的配制：取孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的孔雀石绿标准储备液，取隐色孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的隐色孔雀石绿标准储备液，然后分别取孔雀石绿标准储备液和隐色孔雀石绿标准储备液各20μl于同一个20ml的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至20ml，得到混合标准溶液；所述孔雀石绿标准物质和隐色孔雀石绿标准物质的纯度均大于98％；(2)混合内标标准溶液的配制：分别取浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液和浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液各12.5μl于同一个25ml的容量瓶中，用乙腈稀释定容至25ml，配制成混合内标标准溶液，并置于-18℃下避光保存；所述氘代孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液；所述氘代隐色孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代隐色孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液；(3)混合标准工作溶液的配制：分别精密量取混合标准溶液7.50μl、12.5μl、25.0μl、50.0μl、100μl、250μl、500μl于7个10ml的棕色容量瓶中，然后分别加入混合内标标准溶液250μl，再用提取剂b稀释定容至10ml，配制成孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度均分别为0.075ng/ml、0.125ng/ml、0.250ng/ml、0.500ng/ml、1.000ng/ml、2.500ng/ml、5.000ng/ml的混合标准工作溶液，每个浓度梯度的混合标准工作液中氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿的浓度均为2.5ng/ml；所述提取剂b为酸化乙腈，具体是按照无水甲酸与乙腈为1:999的体积比将无水甲酸和乙腈混合得到的；(4)提取剂a的配制：用重蒸馏水溶解无水乙酸铵配制得到摩尔浓度为2.5mol/l的乙酸铵溶液作为提取剂a；(5)提取：取水产品可食部位绞碎后制成样品，称取5.00g样品于50ml离心管中，加入5ml提取剂c，混匀，再加入15ml的提取剂b，先用均质器均质后，然后再超声提取10min；所述提取剂c是取2ml提取剂a，用去离子水稀释，分别加入氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液各50μl，再用去离子水定容至1000ml得到提取剂c；(6)净化：将经过步骤(5)处理后的离心管置于离心机中，在转速为4000r/min的条件下离心5min，然后取上清液经0.22μm滤膜过滤后得到待测样品溶液；(7)测定：使用液相色谱-串联质谱仪，分别测定待测样品溶液和一系列浓度梯度的混合标准工作溶液，以孔雀石绿的峰面积与氘代孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中孔雀石绿的浓度，线性回归方程和相关系数见表7，以隐色孔雀石绿的峰面积与氘代隐色孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，隐色孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中隐色孔雀石绿的浓度，线性回归方程和相关系数见表7，然后再按照如下式(4)计算得到样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，计算结果需扣除空白值，式(4)中，x为样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，单位为μg/kg；c为待测样品溶液中孔雀石绿或隐色孔雀石绿的浓度，单位为ng/ml；v为待测样品溶液的测定体积，单位为ml；m为样品的质量，单位为g；所述液相色谱-串联质谱仪测定是在以下条件下进行的：a、色谱柱：c18(2.1mm×100mm，1.9μm)，前端接保护柱；b、流动相：流动相a的配制具体是移取1ml提取剂a，加入0.5ml无水甲酸，用去离子水稀释定容至500ml；流动相b为乙腈；梯度洗脱程序见表1，以下所述经过优化后的梯度洗脱程序有利于将目标物与基质分开，可以使样品基质先于待测物流出色谱柱，通过切换阀设置将待测物出峰前的流出液切换至废液，减少离子化时基质在雾滴表面对待测物产生的竞争抑制，避免样品基质污染质谱仪，接着将切换阀切换至质谱仪，待测物完全出峰后，再次切换至废液，平衡色谱柱不小于2min，即梯度洗脱程序的前2～2.5min及后2～3min流出液均可排入废液，中间时段的流出液进入质谱分析；表1梯度洗脱程序时间/min流动相a/％流动相b/％0.0080.020.01.0080.020.02.002.098.07.002.098.07.1080.020.09.0080.020.0c、流速：0.2ml/min；d、柱温：30℃；e、进样量：20μl；f、离子源：esi，正离子模式；g、扫描方式：多反应监测srm；h、雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；i、喷雾电压3500v、离子传输管温度350℃、蒸发温度250℃、碰撞气压力1.5mtorr、鞘气流速40bar、辅助气流速10bar；j、监测离子对、碰撞能、透镜电压见表2；表2监测离子对、碰撞能、透镜电压(10)空白试验：除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；(11)方法验证：选择未检出孔雀石绿和隐色孔雀石绿的样品为空白样品，添加不同量的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品按试验方法处理后测定，根据信噪比计算检出限(3s/n)和定量限(10s/n)，结果见表7；添加2.5μg/kg浓度水平的加标量，制备6个加标样品，在上述试验条件下，做回收率及精密度试验，结果见表7。水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析试剂盒，其包括本实施例所述的混合标准溶液、氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液、提取剂a、提取剂b。实施例2：水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法，其包括以下步骤：(1)混合标准溶液的配制：取孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的孔雀石绿标准储备液，取隐色孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的隐色孔雀石绿标准储备液，然后分别取孔雀石绿标准储备液和隐色孔雀石绿标准储备液各20μl于同一个20ml的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至20ml，得到混合标准溶液；所述孔雀石绿标准物质和隐色孔雀石绿标准物质的纯度均大于98％；(2)混合内标标准溶液的配制：分别取浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液和浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液各20μl于同一个20ml的容量瓶中，用乙腈稀释定容至20ml，配制成混合内标标准溶液，并置于-18℃下避光保存；所述氘代孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液；所述氘代隐色孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代隐色孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液；(3)混合标准工作溶液的配制：分别精密量取混合标准溶液5.00μl、10.0μl、20.0μl、50.0μl、100μl、200μl、400μl于7个10ml的棕色容量瓶中，然后分别加入混合内标标准溶液100μl，再用提取剂b稀释定容至10ml，配制成孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度均分别为0.050ng/ml、0.100ng/ml、0.200ng/ml、0.500ng/ml、1.000ng/ml、2.000ng/ml、4.000ng/ml的混合标准工作溶液，每个浓度梯度的混合标准工作液中氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿的浓度均为2ng/ml；所述提取剂b为酸化乙腈，具体是按照无水甲酸与乙腈为1:999的体积比将无水甲酸和乙腈混合得到的；(4)提取剂a的配制：用重蒸馏水溶解无水乙酸铵配制得到摩尔浓度为2.5mol/l的乙酸铵溶液作为提取剂a；(5)提取：取水产品可食部位绞碎后制成样品，称取2.00g样品于50ml离心管中，加入5ml提取剂c，混匀，再加入10ml的提取剂b，先用手剧烈摇散样品达到均质的效果，然后再超声提取15min；所述提取剂c是取1ml提取剂a，用去离子水稀释，分别加入氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液各15μl，再用去离子水定容至500ml得到提取剂c；(6)净化：将经过步骤(5)处理后的离心管置于离心机中，在转速为2000r/min的条件下离心10min，然后取上清液经0.2μm滤膜过滤后得到待测样品溶液；(7)测定：使用液相色谱-串联质谱仪，分别测定待测样品溶液和一系列浓度梯度的混合标准工作溶液，以孔雀石绿的峰面积与氘代孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中孔雀石绿的浓度，线性回归方程和相关系数见表7，以隐色孔雀石绿的峰面积与氘代隐色孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，隐色孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中隐色孔雀石绿的浓度，线性回归方程和相关系数见表7，然后再按照如下式(4)计算得到样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，计算结果需扣除空白值，式(4)中，x为样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，单位为μg/kg；c为待测样品溶液中孔雀石绿或隐色孔雀石绿的浓度，单位为ng/ml；v为待测样品溶液的测定体积，单位为ml；m为样品的质量，单位为g；所述液相色谱-串联质谱仪测定是在以下条件下进行的：a、色谱柱：c18(2.1mm×50mm，1.9μm)，前端接保护柱；b、流动相：流动相a的配制具体是移取1ml提取剂a，加入0.5ml无水甲酸，用去离子水稀释定容至500ml；流动相b为乙腈；梯度洗脱程序见表3，以下所述经过优化后的梯度洗脱程序有利于将目标物与基质分开，可以使样品基质先于待测物流出色谱柱，通过切换阀设置将待测物出峰前的流出液切换至废液，减少离子化时基质在雾滴表面对待测物产生的竞争抑制，避免样品基质污染质谱仪，接着将切换阀切换至质谱仪，待测物完全出峰后，再次切换至废液，平衡色谱柱不小于2min，即梯度洗脱程序的前2～2.5min及后2～3min流出液均可排入废液，中间时段的流出液进入质谱分析；表3梯度洗脱程序时间/min流动相a/％流动相b/％0.0080.020.00.5080.020.02.005.095.06.005.095.06.1080.020.08.0080.020.0c、流速：0.2ml/min；d、柱温：35℃；e、进样量：20μl；f、离子源：esi，正离子模式；g、扫描方式：多反应监测srm；h、雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；i、喷雾电压3503v、离子传输管温度350℃、蒸发温度250℃、碰撞气压力1.5mtorr、鞘气流速40bar、辅助气流速10bar；j、监测离子对、碰撞能、透镜电压见表4；表4监测离子对、碰撞能、透镜电压(10)空白试验：除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；(11)方法验证：选择未检出孔雀石绿和隐色孔雀石绿的样品为空白样品，添加不同量的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品按试验方法处理后测定，根据信噪比计算检出限(3s/n)和定量限(10s/n)，结果见表7；添加2.5μg/kg浓度水平的加标量，制备6个加标样品，在上述试验条件下，做回收率及精密度试验，结果见表7。水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析试剂盒，其包括本实施例所述的混合标准溶液、氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液、提取剂a、提取剂b。实施例3：水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析方法，其包括以下步骤：(1)混合标准溶液的配制：取孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的孔雀石绿标准储备液，取隐色孔雀石绿标准物质用乙腈溶解得到浓度为100μg/ml的隐色孔雀石绿标准储备液，然后分别取孔雀石绿标准储备液和隐色孔雀石绿标准储备液各20μl于同一个20ml的容量瓶中，用乙腈稀释并定容至20ml，得到混合标准溶液；所述孔雀石绿标准物质和隐色孔雀石绿标准物质的纯度均大于98％；(2)混合内标标准溶液的配制：分别取浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液和浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液各12.5μl于同一个25ml的容量瓶中，用乙腈稀释定容至25ml，配制成混合内标标准溶液，并置于-18℃下避光保存；所述氘代孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代孔雀石绿标准溶液；所述氘代隐色孔雀石绿标准溶液是用乙腈溶解纯度大于98％的氘代隐色孔雀石绿同位素内标标准物质配制成浓度为200μg/ml的氘代隐色孔雀石绿标准溶液；(3)混合标准工作溶液的配制：分别精密量取混合标准溶液7.5μl、12.5μl、25.0μl、50.0μl、100μl、250μl、500μl于7个10ml的棕色容量瓶中，然后分别加入混合内标标准溶液200μl，再用稀释剂稀释定容至10ml，配制成孔雀石绿和隐色孔雀石绿浓度均分别为0.075ng/ml、0.125ng/ml、0.250ng/ml、0.500ng/ml、1.000ng/ml、2.500ng/ml、5.000ng/ml的混合标准工作溶液，每个浓度梯度的混合标准工作液中氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿的浓度均为2ng/ml；所述稀释剂是由以下体积分数的组分组成的：20％流动相a、80％流动相b；(4)提取剂a的配制：用重蒸馏水溶解无水乙酸铵配制得到摩尔浓度为2.5mol/l的乙酸铵溶液作为提取剂a；(5)提取：取水产品可食部位绞碎后制成样品，称取3.05g样品于50ml离心管中，加入10ml提取剂c，用手剧烈摇散样品，再加入15ml的提取剂b，先用均质器均质，然后再用振荡器振荡提取12min；所述提取剂c是取2ml提取剂a，用去离子水稀释，分别加入氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液各25μl，再用去离子水定容至1000ml得到提取剂c；(6)净化：将经过步骤(5)处理后的离心管置于离心机中，在转速为8000r/min的条件下离心5min，然后取上清液经0.22μm滤膜过滤后得到待测样品溶液；(7)测定：使用液相色谱-串联质谱仪，分别测定待测样品溶液和一系列浓度梯度的混合标准工作溶液，以孔雀石绿的峰面积与氘代孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中孔雀石绿的浓度，线性回归方程和相关系数见表7，以隐色孔雀石绿的峰面积与氘代隐色孔雀石绿的峰面积的比值为纵坐标，隐色孔雀石绿的质量浓度为横坐标进行回归分析，计算得到待测样品溶液中隐色孔雀石绿的浓度，线性回归方程和相关系数见表7，然后再按照如下式(4)计算得到样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，计算结果需扣除空白值，式(4)中，x为样品中孔雀石绿或隐色孔雀石绿药物残留的含量，单位为μg/kg；c为待测样品溶液中孔雀石绿或隐色孔雀石绿的浓度，单位为ng/ml；v为待测样品溶液的测定体积，单位为ml；m为样品的质量，单位为g；所述液相色谱-串联质谱仪测定是在以下条件下进行的：a、色谱柱：c18(2.1mm×100mm，1.9μm)，前端接保护柱；b、流动相：流动相a的配制具体是移取2ml提取剂a，加入1.0ml无水甲酸，用去离子水稀释定容至1000ml；流动相b为乙腈；梯度洗脱程序见表5，以下所述经过优化后的梯度洗脱程序有利于将目标物与基质分开，可以使样品基质先于待测物流出色谱柱，通过切换阀设置将待测物出峰前的流出液切换至废液，减少离子化时基质在雾滴表面对待测物产生的竞争抑制，避免样品基质污染质谱仪，接着将切换阀切换至质谱仪，待测物完全出峰后，再次切换至废液，平衡色谱柱不小于2min，即梯度洗脱程序的前2～2.5min及后2～3min流出液均可排入废液，中间时段的流出液进入质谱分析；表5梯度洗脱程序时间/min流动相a/％流动相b/％0.0080.020.00.5080.020.02.002.098.06.502.098.06.6080.020.09.0080.020.0c、流速：0.2ml/min；d、柱温：30℃；e、进样量：20μl；f、离子源：esi，正离子模式；g、扫描方式：多反应监测srm；h、雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；i、喷雾电压3500v、离子传输管温度350℃、蒸发温度250℃、碰撞气压力1.5mtorr、鞘气流速40bar、辅助气流速10bar；j、监测离子对、碰撞能、透镜电压见表6；表6监测离子对、碰撞能、透镜电压(10)空白试验：除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；(11)方法验证：选择未检出孔雀石绿和隐色孔雀石绿的样品为空白样品，添加不同量的孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品按试验方法处理后测定，根据信噪比计算检出限(3s/n)和定量限(10s/n)，结果见表7；添加2.0μg/kg浓度水平的加标量，制备6个加标样品，在上述试验条件下，做回收率及精密度试验，结果见表7。水产品中孔雀石绿残留量的快速定量分析试剂盒，其包括本实施例所述的混合标准溶液、氘代孔雀石绿标准溶液、氘代隐色孔雀石绿标准溶液、提取剂a、提取剂b。表7线性回归方程、检出限、定量限、回收率和精密度由表7可见，应用本发明方法检测水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量，方法的线性范围宽、检出限低，检测结果的回收率高、重现性好。对比例：将gb/t19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》中所述检测方法与实施例1所述检测方法进行处理流程对比，具体流程见图2；与传统方法相比较，本发明方法可极为显著地减少样品前处理步骤，使操作更为简单，缩短样品处理时间，大幅度提高工作效率，实现大批量样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量的快速定量分析。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页12