一种检测血液样品中百草枯和/或敌草快的方法和试剂盒与流程

本发明属于农药检测物分析
技术领域：
，具体提供一种检测血液样品中百草枯和/或敌草快的方法和试剂盒。
背景技术：
：本发明
背景技术：
中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。百草枯(paraquat)，化学名为1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯盐，敌草快(diquat)，又名杀草快、双快，化学名为1,1’-亚乙基-2,2’-联吡啶二溴盐，二者化学性质相近，均属于联吡啶类季铵盐，是一种廉价、作用迅速的非选择性触杀灭生型除草剂。其中百草枯毒性较强，目前无特效解毒方法，我国百草枯中毒患者死亡率已高达85％～90％。研究表明，百草枯可经皮肤、黏膜、呼吸道、消化道等进入人体，在心、肝、脑、肾等脏器均有分布，其中以肺部分布最多，损伤最大，肺纤维化伴呼吸衰竭是患者中毒后期死亡的主要原因。由于百草枯毒性极大，会造成心肺和多种器官的严重损害，近年来百草枯水剂已被禁止在国内销售，敌草快逐步取代百草枯在国内除草剂市场销售量剧增，从而导致敌草快中毒的病例报告也相应增加，但由于敌草快的成本较高且杀草谱有限，一些不法企业在敌草快水剂中添加隐性成分百草枯，有的甚至于将百草枯水剂标称为敌草快水剂进行销售。经过毒性检验证实，很多市售名为“敌草快”的商品绝大多数仍然是“百草枯”。实际上，真正的敌草快毒理学特点与百草枯有明显差别，敌草快中毒与百草枯中毒临床表现也不一致。现代医学普遍认为通过掌握患者就诊时的血药浓度及中毒时间即可评估患者预后情况。临床显示，及时准确地早期诊断中毒并对中毒患者血浆毒物浓度(尤其是全血或血浆)进行检测，如何快速判断除草剂标本究竟是敌草快还是百草枯，对于临床制定合理的治疗方案，提高患者的治愈率，降低死亡率都有重要的意义。百草枯和敌草快受自身理化性质因素影响，在反相色谱柱上很难保留，浓度测定存在较大难度，百草枯的分析检测方法有紫外分光光度法，液相色谱法，气相色谱质谱联用等多种方法，其提取方法也有液液萃取法,固相萃取法等多种,但操作繁琐，费时费力，不利于临床实践应用。发明人发现，目前国内外报道的检测方法主要有气相色谱串联质谱法(gc-ms)、液相色谱法(hplc)和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)。但以上方法的报道多数是用于环境中除草剂含量的监测，用于血浆中百草枯和敌草快含量检测的方法较少，且报道的方法前处理过程繁琐，不适宜广泛应用。技术实现要素：针对现有技术中的不足，本发明提供一种检测血液样品中百草枯和/或敌草快的方法。本发明通过对样本前处理方法和液相色谱串联质谱条件的优化，从而可以同时分析百草枯和敌草快，同时配合配套检测试剂盒，使其能广泛应用于我国除草剂毒物筛查，以及对百草枯、敌草快中毒患者的精确定量分析，因此具有良好的实际应用之价值。为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：本发明的第一个方面，提供一种检测血液样品中百草枯和/或敌草快的方法，所述方法包括：将待测血液样品进行前处理后进行lc-ms/ms检测。其中，所述前处理过程包括：向血液样品中加入含内标的乙腈溶剂进行蛋白沉淀后，取上清液后再加入甲酸水溶液，取上清液用于后续检测。其中，所述血液样品是血浆或血清，优选为血浆；所述色谱条件：流动相a：甲酸-甲酸铵水溶液；流动相b：含甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱。质谱条件：采用电喷雾离子化的正离子电离模式，对待测物质进行定性和/或定量检测。本发明的第二个方面，提供一种用于检测血液样品中百草枯和/或敌草快的试剂盒，所述试剂盒至少包括：甲醇、乙腈、甲酸铵、甲酸、标准品和质控品。本发明的第三个方面，提供上述检测方法和/或试剂盒在如下应用：a)除草剂毒物筛查；b)百草枯、敌草快中毒患者的精确定量分析。以上一个或多个技术方案的有益技术效果：上述方案建立了直接蛋白沉淀法提取，液相色谱串联质谱法，通过对样本前处理方法、液相色谱条件和质谱条件的优化，从而成功构建用于检测血液样品中百草枯和/或敌草快的方法，该方法快速、结果准确、操作方法简便，灵敏度好、特异性强，制备和检测价格较为低廉，适用于临床中毒患者中的毒物筛查和定量检测，因此具有良好的实际应用之价值。附图说明构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。图1为本发明实施例百草枯标准曲线；图2为本发明实施例敌草快定量离子对色谱图；图3为本发明实施例敌草快定量离子对二级质谱图；图4为本发明实施例敌草快标准曲线；图5为本发明实施例百草枯定量离子对色谱图；图6为本发明实施例百草枯定量离子对二级质谱图；图7为本发明实施例空白血浆色谱图；图8为本发明实施例百草枯样品检测过程空白样本色谱图；图9为本发明实施例百草枯样品检测过程空白血浆色谱图；图10为本发明实施例敌草快样品检测过程空白样本色谱图；图11为本发明实施例敌草快样品检测过程空白血浆色谱图；图12为本发明实施例中hilic色谱柱出峰效果图；图13为本发明实施例中aq色谱柱出峰效果图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
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的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如前所述，目前国内外报道的检测方法主要有气相色谱串联质谱法(gc-ms),液相色谱法(hplc)和液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)。但以上方法的报道多数是用于环境中除草剂含量的监测，用于血浆中百草枯和敌草快含量检测的方法较少，且报道的方法前处理过程繁琐，不适宜广泛应用。有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种检测血液样品中百草枯和/或敌草快的方法，所述方法包括：将待测血液样品进行前处理后进行lc-ms/ms检测。其中，所述前处理过程包括：向血液样品中加入向血液样品中加入含内标的乙腈溶剂进行蛋白沉淀后，离心取上清液后向其中加入甲酸水溶液，再离心取上清液用于后续检测。其中，所述血液样品是血浆或血清，优选为血浆；本发明的又一具体实施方式中，所述甲酸水溶液中甲酸含量为0.1～0.3％，优选为0.2％。本发明的又一具体实施方式中，血液样本、内标溶液、乙腈溶液和甲酸水溶液的体积比为80-120:10-30:360-400:10-30；优选为100:20:380:20。在样本检测前，通常需要将样本进行处理提纯后再进行检测，血浆样本的前处理方法包括沉淀蛋白法、液液萃取法和固相萃取法等，由于百草枯和敌草快属于季铵类盐，易溶于水，难溶于有机溶剂，因此不能采用有机溶剂萃取法来提取，而固相萃取法成本较高，前处理步骤复杂，不适合大批量应用。本发明采用同位素内标法用乙腈溶剂对血浆样本进行蛋白沉淀后，再通过加入一定比例的甲酸水溶液来提高离子化效应和稳定性，然后直接上机检测，操作简便可行，灵敏度高、准确度和重复性良好。所述色谱条件：流动相a：甲酸-甲酸铵水溶液；流动相b：含甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱。在液相条件的优化中，柱温和流速均能影响到敌草快的保留时间和响应，同时提高温度、降低流速可减少色谱柱的压力，该方法将初始流动相设置为高比例水相可延长敌草快在色谱柱的保留时间，从而减少血浆中杂质的干扰。本方法经过优化后，选择采用甲醇和水作为流动相，水相中加入0.2％甲酸和5mmol/l甲酸铵有助于提高灵敏度和优化峰形。同时，由于百草枯和敌草快的强极性和正电荷，难以在普通的反相色谱柱中保留，文献中所报道的lc-ms/ms检测方法多采用hilic柱来进行色谱分离。本发明在色谱柱的选择中一开始也尝试了采用hilic柱进行分析，但hilic柱保留较强，峰形拖尾比较严重，需要加入高浓度盐来优化峰形，但高浓度盐又容易造成管路的堵塞，在实际应用中效果不好。因此，本发明建立的lc-ms/ms法是基于一种特殊设计的色谱柱thermohypersilgoldaq柱来实现敌草快的色谱保留，不同于常规的色谱柱，该柱对极性样品具有良好的保留值和分离度，并且可以在100％水溶液流动相具有较强的稳定性，这一特点可以使极性较大的敌草快在高比例水相中产生保留，弥补了敌草快在普通的反相色谱柱中无法保留的缺陷，而且可提供极佳的峰形，有利于提高检出限。上述梯度洗脱具体程序如下：洗脱程序洗脱溶液程序时间1流动相b为5％0.00-1.5min2流动相b为5％-20％1.5-1.8min3流动相b为95％1.8-2.80min4流动相b为95％2.80-3.7min5流动相b为55％3.7-3.80min6流动相b为5％3.80-4.00min7流动相b为5％4.00-5.00min质谱条件：采用电喷雾离子化的正离子电离模式，对待测物质进行定性和/或定量检测。百草枯和敌草快均属于联吡啶类季铵盐，易溶于水，具有强离子特性，可电离形成二价阳离子。根据二者的结构特点，选择电喷雾正离子电离模式，取1000ng/ml的百草枯和敌草快标准溶液，分别直接进样质谱仪进行全扫描，得到百草枯的准分子离子对，会出现m/z186/171、185/169、93/171，敌草快的准分子离子对，会出现m/z183.2/157.2、183.2/130.2，但在样品分析时，m/z186作为母离子虽然灵敏度比较高，但容易产生干扰信号，影响定量，而作为[m2+h]离子对93/171作为定量离子对干扰小，且信号更稳定，因此百草枯选择m/z93.2/171作为定量离子对，在mrm模式下，进一步优化子离子碰撞能量。进一步的，质谱条件为：电喷雾离子源(esi)，正离子模式，多反应通道扫描模式(mrm)；离子源电压为5500v，脱溶剂气温度为500℃，雾化气(gas1)为50psi，辅助加热气(gas2)为50psi，气帘气(curtaingas)为10psi，敌草快及敌草快内标优化采集质谱参数如下：本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测血液样品中百草枯和/或敌草快的试剂盒，所述试剂盒至少包括：甲醇、乙腈、甲酸铵、甲酸、标准品和质控品。本发明的又一具体实施方式中，提供上述检测方法和/或试剂盒在如下应用：a)除草剂毒物筛查；b)百草枯、敌草快中毒患者的精确定量分析。以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。所使用的原料如无特别说明，均为市售的常规产品。实施例1.设备与试剂1.1主要设备1.2试剂甲醇(merck、hplc)乙腈(merck、hplc)甲酸铵(sigma，lc-ms/ms)甲酸(sigma，lc-ms/ms)水：超纯水(屈臣氏)。2.缩略语缩写说明缩写说明bck百草枯bck-d8百草枯-d8内标dck敌草快3.lc/ms/ms分析方法3.1液相色谱条件色谱柱：thermohypersilgoldaq柱(100mm*2.1mm，1.9μm)。流动相a：含0.2％甲酸-5mmol/l甲酸铵水溶液，涡旋混合1min后超声10min混匀，0.22μm滤膜(水膜)过滤，超声10mins脱气；流动相b：含0.2％甲酸-甲醇溶液，涡旋混合1min后超声10min混匀，0.22μm滤膜(油膜)过滤，超声10mins脱气。采用流速：200μl/min；柱温：40℃；进样量：10μl。梯度洗脱：洗脱程序洗脱溶液程序时间1流动相b为5％0.00-1.5min2流动相b为5％-20％1.5-1.8min3流动相b为95％1.8-2.80min4流动相b为95％2.80-3.7min5流动相b为55％3.7-3.80min6流动相b为5％3.80-4.00min7流动相b为5％4.00-5.00min3.2质谱条件电喷雾离子源(esi)，正离子模式，多反应通道扫描模式(mrm)；离子源电压为5500v，脱溶剂气温度为500℃，雾化气(gas1)为50psi，辅助加热气(gas2)为50psi，气帘气(curtaingas)为10psi，敌草快及敌草快内标优化采集质谱参数如下：3.3待测样品处理方法：(1)将待测血浆样本、标准品、质控品、试剂取出放置室温(23±2)℃并混匀；(2)分别取待测样本、标准品、质控品、空白样本各100μl于1.5mlep管中，先加入乙腈溶液380μl，再加入内标溶液20μl，2000rpm涡旋混匀1min；13000rpm，离心5min；(3)取上清液180μl于96孔板中，加入20μl0.2％甲酸-水溶液，涡旋混匀1min，13000rpm，离心5min；(4)取150μl上清液转移至96孔板中，为高效液相色谱-串联质谱的检测作准备。3.4标准曲线样品及质控样品浓度4.性能验证内容及接受标准4.1标准曲线取bck和dck校准品的7个标准曲线样本，按照“3.3待测样品处理方法”处理，共考察3批的标准曲线。数据接受标准：标准曲线上最低浓度样品中每个化合物的相对误差(re)和相对标准偏差(rsd)均在±20％之内，其他浓度的样品中每个化合物相对误差(re)和相对标准偏差(rsd)在±20％以内，相关系数r均在0.9900以上。4.2精密度和准确度取bck和dck质控品(qcl、qch)各3份，按照“3.3待测样品处理方法”处理，利用标准曲线计算该批次的高、低质控品的浓度，得到每个样品的相对误差(re)和相对标准偏差(rsd)。连续3天至少考察3批样品。数据接受标准：bck和dck每个化合物的相对误差(re)在上下限之内，相对标准偏差(rsd)在15％以内。4.3定量下限(lloq)取bck和dck校准品j1样品6份，按照“3.3待测样品处理方法”处理，利用标准曲线计算该批次的定量下限样品的浓度，得到每个样品每个化合物的相对误差(re)和相对标准偏差(rsd)。数据接受标准：每个样品中每个化合物的相对误差(re)和相对标准偏差(rsd)均在±20％之内。4.4携带效应通过进样最高定量上限样品(j1)后运行1个双空白样品(db)来进行评估，考察6次。数据接收标准：分析物测定的残留应≤20％分析物定量下限，同时对内标测定的残留应≤5％内标峰面。5.数据处理方法使用absciex公司的analyst1.6.2软件输出原始图谱、浓度等数据，权重因子选择1/x，利用microsoftexcel2013计算均值，误差、标准偏差，相对标准偏差等参数。标准曲线的线性回归方程：y＝bx+ay:分析物与内标的峰面积比；x:分析物的浓度；r:相关系数6.性能验证结果6.1bck验证结果6.1.1标准曲线与线性范围在性能验证期间共制备和测定标准曲线3条，标准曲线结果数据及回归方程参数分别见表1和表2。结果表明：bck浓度在100～10000ng/ml范围内，浓度与峰面积的比值具有良好的线性关系，标准曲线各浓度点实测值的re为-3.5～4.5％，平均相关系数r为0.995以上。表1:bck标准曲线计算浓度结果统计表2:bck标准曲线参数统计datafilebar2019.12.25-bck0.0004390.01210.99822019.12.26-bck0.00130.003030.99992019.12.27-bck0.001190.002150.99976.1.2精密度与准确度性能验证考察精密度与准确度试验中，各浓度质控样本的实测值及统计结果见表3。表3：bck精密度和准确度统计表6.1.3定量下限(lloq)性能验证考察定量下限，bck实测值及统计结果见表4。结果表明：本方法测定的bck的lloq样品的re为-5.3％～4％，rsd为3.32％，即方法的定量下限符合数据接受标准。表4:bck的lloq统计表6.1.4空白试剂bck试剂空白无检出，见图8。6.1.5空白血浆空白血浆中无干扰效应，见图9。6.1.6残留效应bck样本高浓度进样后有一定的残留效应，残留<定量下限的20％，不影响定量检测。6.2dck验证结果6.2.1标准曲线与线性范围在性能验证期间共制备和测定标准曲线3条，标准曲线结果数据及回归方程参数分别见表5和表6。结果表明：dck浓度在100～5000ng/ml范围内，浓度与峰面积的比值具有良好的线性关系，标准曲线各浓度点实测值的re为-10.4～19％，平均相关系数r为0.995以上。表5:dck标准曲线计算浓度结果统计表6:dck标准曲线参数统计6.2.2精密度与准确度性能验证考察精密度与准确度试验中，各浓度质控样本的实测值及统计结果见表7。表7：dck精密度和准确度统计表6.2.3定量下限(lloq)性能验证考察定量下限，dck3实测值及统计结果见表8。结果表明：本方法测定的dck的lloq样品的re为16％～28％，rsd为3.38％，即方法的定量下限符合数据接受标准。表8:dcklloq统计表6.2.4试剂空白试剂空白中无干扰，结果见图10。6.2.5空白血浆空白血浆中无干扰影响，结果见图11。6.2.6携带效应dck样本高浓度进样后有一定的残留效应，残留<定量下限的20％，不影响定量检测。本实施例在利用api3200mdlc-ms/ms液质联用仪开展检测患者血浆中建立的bck和dck液相色谱-串联质谱法进行性能验证，验证结果良好，bck和dck的各项性能指标均符合要求，可准确测定人患者血浆中bck和dck的浓度。7.方法优化过程7.1质谱条件的优化百草枯和敌草快均属于联吡啶类季铵盐，易溶于水，具有强离子特性，可电离形成二价阳离子。根据二者的结构特点，选择电喷雾正离子电离模式，取1000ng/ml的百草枯和敌草快标准溶液，分别直接进样质谱仪进行全扫描，得到百草枯的准分子离子对，会出现m/z186/171、185/169、93/171，敌草快的准分子离子对，会出现m/z183.2/157.2、183.2/130.2，但在样品分析时，m/z186作为母离子虽然灵敏度比较高，但容易产生干扰信号，影响定量，而作为[m2+h]离子对93/171作为定量离子对干扰小，且信号更稳定，因此百草枯选择m/z93.2/171作为定量离子对，在mrm模式下，进一步优化子离子碰撞能量。7.2液相条件的优化由于百草枯和敌草快的强极性和正电荷，难以在普通的反相色谱柱中保留，文献中所报道的lc-ms/ms检测方法多采用hilic柱来进行色谱分离。本研究在色谱柱的选择中一开始也尝试了采用hilic柱进行分析，但hilic柱保留较强，峰形拖尾比较严重，需要加入高浓度盐来优化峰形，但高浓度盐又容易造成管路的堵塞，在实际应用中效果不好，如图12。本研究建立的lc-ms/ms法是基于一种特殊设计的色谱柱thermohypersilgoldaq柱来实现敌草快的色谱保留，不同于常规的色谱柱，该柱可以在100％水溶液流动相具有较强的稳定性，这一特点可以使极性较大的敌草快在高比例水相中产生保留，弥补了敌草快在普通的反相色谱柱中无法保留的缺陷，而且可提供极佳的峰形，有利于提高检出限，见图13。7.3前处理条件和色谱条件的确定在样本检测前，通常需要将样本进行处理提纯后再进行检测，血浆样本的前处理方法包括沉淀蛋白法、液液萃取法和固相萃取法等，由于百草枯和敌草快属于季铵类盐，易溶于水，难溶于有机溶剂，因此不能采用有机溶剂萃取法来提取，而固相萃取法成本较高，前处理步骤复杂，不适合大批量应用。本研究采用同位素内标法用乙腈溶剂对血浆样本进行蛋白沉淀后，再加入一定比例的甲酸水溶液，可提高离子化效应和稳定性，然后再直接上机检测，操作简便可行。在液相条件的优化中，柱温和流速均能影响到敌草快的保留时间和响应，同时提高温度、降低流速可减少色谱柱的压力，该方法将初始流动相设置为高比例水相可延长敌草快在色谱柱的保留时间，从而减少血浆中杂质的干扰。本方法经过优化后，选择采用甲醇和水作为流动相，水相中加入0.2％甲酸和5mmol/l甲酸铵有助于提高灵敏度和优化峰形。综上，本方法建立了直接蛋白沉淀法提取，高效液相色谱串联质谱法检测血液中百草枯和敌草快的方法，该方法操作简单、灵敏度好、特异性强，适用于临床中毒患者中的毒物筛查和定量检测。本发明未尽事宜为公知技术。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。当前第1页12