注射剂中泊洛沙姆188的检测方法与流程

本发明属于药品辅料检测领域，尤其涉及一种注射剂中泊洛沙姆188的检测方法。
背景技术：
：近几年，国家从政策层面规定了对仿制药的质量和疗效进行一致性评价，其中生物等效性无疑是其核心内容。而对药用辅料质量的把控，是保证药物质量的又一个关键因素，也是评价生物等效性的重要环节。其中，对注射剂类药用辅料的质量和安全性的控制尤为严格。泊洛沙姆(poloxamer)是一类聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，属于非离子型表面活性剂，是一种常用的高分子药用辅料，主要作为增溶剂和乳化剂应用于药物制剂中。其中，泊洛沙姆188(poloxamer188，商品名pluronic-f68，简称p188)是泊洛沙姆系列中具有相对最佳乳化性能和安全性的一种辅料，性质稳定，毒性较低，生物相容性较好。目前中国药典(2015版)和美国药典均有收录p188，但相对于中国药典，美国药典对p188质量标准要求更为严格，可以作为一种静脉注射制剂用于临床，而中国药典仅对其平均分子量采用滴定法进行了规定，只能用于口服制剂。因此，现阶段在注射剂生产过程中若加入p188作为增溶剂或乳化剂，需要对产品中p188残留进行检测。中国专利cn101262918a公开了泊洛沙姆类的检测方法，包括将所述样品进行如下处理的步骤：(a)采用分子筛析色谱柱的分离步骤；(b)采用流动相的洗脱步骤；和(c)检测泊洛沙姆的检测步骤；其中，所述蛋白质的分子量为5-70kda，所述蛋白质是干扰素β或生长激素；且其中所述洗脱步骤中使用的流动相的ph调整为低于3；所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188；所述蛋白质的分子量在20-70kda之间；所述流动相是水性溶剂；所述流动相是缓冲的溶剂；所述流动相的ph调节到1.9-2.0；所述泊洛沙姆的检测步骤包括分析折射率；所述分子筛析色谱柱是填充了含聚合物基质珠的se-hplc柱。然而，上述专利所公开的泊洛沙姆类的检测方法的定量限较高，对于泊洛沙姆含量较低的制剂中泊洛沙姆的含量检测具有很大误差，准确性及灵敏度低。技术实现要素：针对现有技术存在的不足之处，本发明所要解决的技术问题是克服现有泊洛沙姆类检测方法定量限较高，对于泊洛沙姆含量较低的制剂中泊洛沙姆的含量检测具有很大误差，准确性及灵敏度低的问题，提出一种具有检测灵敏度高、准确性好的注射剂中泊洛沙姆188的检测方法。为解决所述技术问题，本发明采用的技术方案为：本发明提供一种注射剂中泊洛沙姆188的检测方法，包括以下步骤：分离步骤，采用反向色谱柱进行分离；洗脱步骤，利用流动相进行洗脱；和检测步骤，采用蒸发光检测器对经过上述洗脱步骤洗脱下来的泊洛沙姆进行检测；所述分离步骤中的参数设定为：柱流速为0.78-0.82ml/min，样品温度为10-20℃，柱温为35-45℃；所述洗脱步骤中流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为体积分数为0.05-0.5％的三氟乙酸水溶液，所述流动相b为体积分数为0.05-0.5％的三氟乙酸的乙腈溶液；所述检测步骤中的参数设定为：气体流速为2.9-3.1l/min，漂移管温度为95-105℃。优选的，所述注射剂为重组人白介素-12注射液。优选的，所述检测步骤中的参数设定为：气体流速为3.0l/min，漂移管温度为100℃。优选的，所述分离步骤中的参数设定为：柱流速为0.78-0.82ml/min，样品温度为10-20℃，柱温为35-45℃，进样量为60μl；所述检测步骤中的参数设定为：气体流速为2.9-3.1l/min，漂移管温度为95-105℃，雾化器温度为90℃。优选的，还包括在分离步骤前采用流动相a和流动相b洗脱至少30min。优选的，还包括在分离步骤前采用50％流动相a和50％流动相b洗脱至少30min。优选的，还包括在进样后的前5min及洗脱步骤后的9min将流向切换到废液通道。优选的，还包括配制浓度为0.5mg/l的泊洛沙姆188标准液，分别以30μl、45μl、60μl、75μl、90μl作为进样体积对所述泊洛沙姆188标准液进行检测，并绘制进样量与峰面积之间关系的标准曲线。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明提供一种注射剂中泊洛沙姆188的检测方法，具有灵敏度高、重现性好的特点，其定量限可以达到0.4μg；2、本发明提供一种注射剂中泊洛沙姆的检测方法，能够有效分离重组人白介素-12中的泊洛沙姆，准确可靠地检测重组人白介素-12中泊洛沙姆188的含量；3、本发明提供一种注射剂中泊洛沙姆188的检测方法，具有检测结果稳定，耐用性好的特点；4、本发明提供一种注射剂中泊洛沙姆188的检测方法，该方法不受溶剂峰的干扰、改变梯度条件不受基线漂移限制，能在多溶剂梯度的情况下获得稳定的基线，使得分辨率更好、分离速度更快。附图说明图1为本发明实施例所提供的空针色谱图；图2为本发明实施例所提供的水的色谱图；图3为本发明实施例所提供的流动相a的色谱图；图4为本发明实施例所提供的流动相b的色谱图；图5为本发明实施例所提供的不含泊洛沙姆188制剂buffer的色谱图；图6为本发明实施例所提供的泊洛沙姆188标准品的色谱图；图7为本发明实施例所提供的泊洛沙姆188检测方法标准曲线1；图8为本发明实施例所提供的泊洛沙姆188检测方法标准曲线2；图9为本发明实施例所提供的泊洛沙姆188检测方法标准曲线3；图10为本发明实施例所提供的泊洛沙姆188检测方法标准曲线(准确度)；图11为本发明实施例所提供的泊洛沙姆188检测标准曲线。具体实施方式下面将结合附图对本发明具体实施例中的技术方案进行详细、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明总的技术方案的部分具体实施方式，而非全部的实施方式。基于本发明的总的构思，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都落于本发明保护的范围。本发明提供一种注射剂中泊洛沙姆188的检测方法，包括以下步骤：分离步骤，采用反向色谱柱进行分离；洗脱步骤，利用流动相进行洗脱；和检测步骤，采用蒸发光检测器对经过上述洗脱步骤洗脱下来的泊洛沙姆进行检测；所述分离步骤中的参数设定为：柱流速为0.78-0.82ml/min，样品温度为10-20℃，柱温为35-45℃；所述洗脱步骤中流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为体积分数为0.05-0.5％的三氟乙酸水溶液，所述流动相b为体积分数为0.05-0.5％的三氟乙酸的乙腈溶液；所述检测步骤中的参数设定为：气体流速为2.9-3.1l/min，漂移管温度为95-105℃。本技术方案提供一种注射剂中泊洛沙姆的检测方法，首先采用反向色谱柱对注射剂中的泊洛沙姆进行分离，然后利用流动相对色谱柱进行洗脱，最后，采用蒸发光检测器对经过上述洗脱步骤洗脱下来的泊洛沙姆进行检测。需要说明的是，本技术方案采用反向色谱柱，根据待测组分极性差异进行分离，利用蒸发光检测器对经过上述洗脱步骤洗脱下来的泊洛沙姆进行检测，首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测，消除了常见于其他高效液相(hplc)检测器的问题，例如，示差检测受溶剂前沿峰的干扰使得分析复杂化，并且由于对温度极其敏感使得基线很不稳定，与梯度洗脱不相容。该检测方法具有灵敏度高、重现性好的特点，其检测限可以达到0.2μg，定量限可以达到0.4μg。作为一种优选，选用赛分polyrp-100色谱柱作为色谱柱，赛分polyrp-100色谱柱的使用可更好的分离泊洛沙姆，并且降低实验的成本。泊洛沙姆188具有高亲水性，反相色谱柱(ods柱)难以保留，作为一种优选，采用具有强疏水性能基质(如高交联度的聚苯乙烯/二乙烯基苯)的柱子，更适合分析分离该类物质的反相分析，可与产品中目的组分(极性物质)实现很好的分离。现有技术采用分子筛分离，在目的组分与泊洛沙姆188相近的情况下，很难实现分离并准确定量。泊洛沙姆188本身没有紫外吸收，该方法选用elsd检测器不要求样品带有发色基团或荧光基团等光学性质，其响应值只与泊洛沙姆188物质的量有关，更代表样品的质量组成。另外，该技术方案具体限定了分析测试的条件，在该测试条件下，能够保证检测结果准确度的加标回收率在80％-120％，进样量峰面积rsd小于5％；精密度rsd小于5％，即该方法的精密度和准确度均符合要求。具体的，当柱流速小于0.78ml/min或大于0.82ml/min时，会影响泊洛沙姆188在色谱柱内的分离效果和色谱柱的使用寿命；当样品温度小于10℃时或大于20℃时，会影响上样准确度及样品稳定性；当柱温小于35℃或大于45℃，气体流速小于2.9l/min或大于3.1l/min，漂移管温度小于95℃或大于105℃时，均会影响泊洛沙姆188的分离检测和结果的稳定性。需要说明的是，柱流速还可以为0.79ml/min、0.80ml/min、0.81ml/min及其范围内的任意点值；样品温度还可以是12℃、14℃、16℃、18℃及其范围内的任意点值；柱温还可以是37℃、40℃、43℃及其范围内的任意点值；气体流速还可以是3.0l/min；漂移管温度还可以是97℃、100℃、103℃及其范围内的任意点值。在一优选实施例中，所述注射剂为重组人白介素-12注射液。在一优选实施例中，所述检测步骤中的参数设定为：气体流速为3.0l/min，漂移管温度为100℃。该技术方案具体限定了检测步骤中的气体流速及漂移管温度，原因在于，微调气体流速和漂移管温度会影响检测结果的稳定性，因此，在检测中需严格控制气体流速和漂移管温度。在一优选实施例中，所述分离步骤中的参数设定为：柱流速为0.78-0.82ml/min，样品温度为10-20℃，柱温为35-45℃，进样量为60μl；所述检测步骤中的参数设定为：气体流速为2.9-3.1l/min，漂移管温度为95-105℃，雾化器温度为90℃。该技术方案具体限定了分离步骤及检测步骤中的参数设定，保证了检测结果的精密度和准确度。另外，在检测步骤中，数据输出速率：12.5hz；选择检测器增益(pmt)和光源强度(led)设置，从而使最高标准不超过1.0伏满量程，该参数根据仪器型号不同可适当进行调整。在一优选实施例中，还包括在分离步骤前采用流动相a和流动相b洗脱至少30min。此操作的主要目的在于平衡色谱系统，有利于色谱系统的稳定，以得到稳定准确的结果。在一优选实施例中，还包括在分离步骤前采用50％流动相a和50％流动相b洗脱至少30min。该技术方案进一步限定了流动相的组成，原因在于，此流动相组成可以更好的衔接检测时流动相梯度，避免系统波动。在一优选实施例中，还包括在进样后的前5min及洗脱步骤后的9min将流向切换到废液通道。该操作能够避免试剂中蛋白或其它辅料对检测器的污染，从而延长仪器寿命。在一优选实施例中，还包括配制浓度为0.5mg/l的泊洛沙姆188标准液，分别以30μl、45μl、60μl、75μl、90μl作为进样体积对所述泊洛沙姆188标准液进行检测，并绘制进样量与峰面积之间关系的标准曲线。为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的注射剂中泊洛沙姆188的检测方法，下面将结合具体实施例进行描述。实施例11)流动相配制：流动相a(0.1％v/vtfa水溶液)；流动相b(0.1％v/vtfa的acn溶液)。2)1.0mg/ml泊洛沙姆188标准品溶液配制：精密称定100mg±10mg泊洛沙姆188，直接转移至配衡容量瓶中。小心加适量纯化水稀释至100ml，避免气泡形成。轻轻在瓶中放入一个磁搅拌子。搅拌溶液15-20min或直到所有泊洛沙姆188溶解。3)供试品稀释：取重组人白介素-12注射液(cho细胞)，稀释至约0.5mg/ml(处方量为1.0mg/ml)，备测。4)蒸发光检测器(elsd)参数设置：气体流速：3.0l/min；雾化器温度90℃；漂移管温度：100℃。数据输出速率：12.5hz；选择检测器增益(pmt)和光源强度(led)设置，从而使最高标准不超过1.0伏满量程。该参数根据仪器型号不同可适当进行调整。5)高效液相色谱(hplc)参数设置：流速：0.8ml/min；进样量：60μl；样品温度：15℃(±5℃)；柱温：40℃(±5℃)。6)洗脱梯度见表1：表1泊洛沙姆188含量检测洗脱梯度时间(min)流动相a(％)流动相b(％)05050650507595155951650502550507)平衡hplc系统：用50％流动相a和b以0.8ml/min的流速平衡hplc系统至少30min。8)进样：标准曲线进样体积分别为30μl(15μg)、45μl(22.5μg)、60μl(30μg)、75μl(37.5μg)、90μl(45μg)；供试品进样60μl。为避免试剂中蛋白或其它辅料对检测器的污染从而延长仪器寿命，在进样后的前5min，及泊洛沙姆188洗脱步骤结束后(9min左右)，将流向切换至废液(注：该操作为非必须步骤)。9)结果计算以泊洛沙姆188峰面积对每个标准品不同水平进样的泊洛沙姆188含量绘图，得到校准曲线。计算测定系数(r2)，并确认r2应≥0.98。计算每次测定供试品中泊洛沙姆188浓度(mg/ml)，精确至小数点后2位。检测结果分析一、对实施例1建立的分析方法进行专属性、准确度、精密度、检测限、定量限、线性、范围和耐用性的验证,并测定了9批重组人il-12注射液中的泊洛沙姆188的量。1、专属性验证实施例1的色谱条件下，空针、a流动相、b流动相进样运行洗脱程序，记录色谱图，考察流动相中成分对泊洛沙姆188检测是否有干扰(泊洛沙姆188保留时间处是否有其他成分峰)。检测结果见图1-图6。由图1-图6可以发现，泊洛沙姆188主峰保留时间在10-15min之间，空白对照、流动相、不含泊洛沙姆188的制剂buffer等在此时间范围内均未出峰，说明上述成分对泊洛沙姆188检测无干扰，该方法具有良好的专属性。2、线性范围用泊洛沙姆188标准品母液精确稀释，制备5个梯度浓度的泊洛沙姆188标准浓度，分别进样检测。每个浓度连续测定3次。以泊洛沙姆188峰面积对每个标准品不同水平进样的泊洛沙姆188含量绘图，得到标准曲线，计算相关系数(r2)，要求每条标准曲线的r2应≥0.98。每个浓度水平3次重复进样峰面积cv不得高于5.0％。结果如表2-表5所示，对应的标准曲线图见图7-图9所示：表2线性标准曲线1表3线性标准曲线2表4线性标准曲线3表5标准曲线各进样量峰面积汇总结论：上述结果显示，三条标准曲线的r2均大于0.98，且各标准曲线同一进样量的峰面积cv均＜5％，表明该标准曲线线性关系良好，符合要求。3、准确度分别取上述配制的泊洛沙姆188母液(1.0mg/ml)60μl、90μl各3份，按实施例1的方法检测泊洛沙姆188浓度，计算泊洛沙姆188的平均加样回收率，即为准确度。要求回收率应在80.0％-120.0％范围内，且cv应≤5.0％。标准曲线峰面积如表6所示，标准曲线如图10所示；准确度计算结果如表7所示。表6标准曲线各进样量峰面积表7方法验证-准确度结论：上述结果显示，加标回收率均在80％-120％范围内，且各进样量峰面积rsd均<5.0％，符合要求。4、精密度分别取上述配制的泊洛沙姆188储存液(0.5mg/ml)60μl，连续进样6次，记录色谱图，计算标准品溶液浓度，要求精密度(rsd％)应小于5.0％。结果如表8所示。表8方法验证-精密度结论：由结果可知，精密度rsd<5.0％，符合要求。5、耐用性微调气体流速、柱流速、漂移管温度，考察上述变化是否影响泊洛沙姆188检测结果。5.1其他条件不变，将柱流速分别调整为0.78ml/min、0.80ml/min、0.82ml/min，检测泊洛沙姆188储备液，进样体积为60μl，进样浓度为0.5mg/ml，考察对检测结果是否有影响，要求各流速下峰面积的rsd％应＜5.0％。结果汇总如表9所示。表9微调柱流速对检测结果的影响结论：由结果可知，改变柱流速，峰面积rsd＜5.0％，符合要求。5.2其他条件不变，调整气体流速为2.9l/min、3.0l/min、3.1l/min，检测泊洛沙姆188储备液，进样体积为60μl，进样浓度为0.5mg/ml，考察对检测结果是否有影响，要求各气体流速下峰面积的rsd％应＜5.0％。为保证结果的准确性，重复进行多次试验，结果汇总如表10所示。表10-1微调气体流速对检测结果的影响表10-2微调气体流速对检测结果的影响表10-3微调气体流速对检测结果的影响结论：由结果可知，改变气体流速，峰面积rsd＞5.0％。5.3其他条件不变，调整漂移管温度为95℃、100℃、105℃，检测泊洛沙姆188储备液，进样体积为60μl，进样浓度为0.5mg/ml，考察对检测结果是否有影响，要求各漂移管温度下峰面积的rsd％应＜5.0％。为保证结果的准确性，重复进行多次试验，结果汇总如表11所示。表11-1微调漂移管温度对检测结果的影响表11-2微调漂移管温度对检测结果的影响结论：由结果可知，改变漂移管温度，峰面积rsd＞5.0％。6、方法验证总结分析由上述验证结果可知，该方法的专属性、线性、精密度和准确度均符合要求。微调柱流速对检测结果无影响，微调气体流速和漂移管温度会影响检测结果的稳定性，因此，在检测中需严格控制气体流速和漂移管温度。7、供试品分析取理论浓度为1mg/ml，编号为注射液1、注射液2、注射液3、注射液4、注射液5、注射液6、注射液7、注射液8、注射液9的重组人白介素-12注射液(cho细胞)按上述方法检测产品中泊洛沙姆188含量，要求结果应在0.70mg/ml-1.3mg/ml范围内。检测中标准曲线的数据汇总如表12所示，标准曲线如图11所示，供试品检测结果如表13所示：表12标准曲线结果汇总表13重组人白介素-12注射液(cho细胞)中泊洛沙姆188含量检测注：所检测样品均为稀释2倍后进样。结论：重组人白介素-12注射液中辅料泊洛沙姆188的处方量为0.1％(1.0mg/ml)。按上述经验证的方法检测10批次重组人白介素-12注射液，泊洛沙姆188平均检出量符合标准(70％-130％)要求。当前第1页12