一种牡丹活体植株挥发性成分的检测方法与流程

本发明属于植物成分检测技术领域，具体地，涉及一种牡丹活体植株挥发性成分的检测方法。

背景技术：

花朵的三个主要观赏特征：花型、花色、花香。其中花香被誉为“花卉的灵魂”，是观赏植物的重要审美指标之一。植物花朵释放的香味可以治疗一些心理和生理疾病，芳香植物中萃取到的芳香化合物在医疗、养生、美容等方面具有重要的应用价值，花香的经济价值日益受到大众追捧。牡丹作为候选国花，是我国特有的芳香植物，素有“花中之王”的美称，以其花大、色艳、香浓而享誉海内外，具有很高的观赏价值。

目前，在芳香植物方面，月季、水仙、蜡梅、玫瑰等植物的香气成分已经确定，但有关牡丹花挥发性成分鉴定的研究报道较少，而这些研究全部采用离体测定的方法，较为常见的有固相微萃取法（spme）和静态顶空法（shs）等。传统离体测定方法会使得花瓣受损、香气成分改变。动态顶空吸附法是一种活体植株挥发性成分采样方法，在牡丹香气成分收集中并未见报道。同时，无论是动态顶空吸附法或是其他检测方法，样品的采集是十分关键的。因为牡丹芳香类挥发性成分无法长时间保存，必须在短时间内快速测定，否则会造成成分的损失或改变，影响结果的准确性。而且牡丹株型较大，根系复杂，花期较短，很难大量取样，在样品采集时，由于现有技术的限制，难以规避上述问题。

气质联用技术(gc-ms)是对挥发性化学成分进行分析鉴定的一种有效手段。近年来，气质联用技术在花香研究中的应用日益普遍。周海梅等采用固相微萃取法（spme）结合气相色谱-质谱（gc-ms）联用技术定性分析不同品种牡丹花的挥发性成分，从10个品种牡丹花中共检出34种成分。李莹莹等采用静态顶空（shs）-气相色谱-质谱（gc-ms）法分离和鉴定出4个品种牡丹花的30种挥发性成分。但不同的取样方法会使花朵挥发性成分具有差异，气相色谱-质谱条件也要随之改变。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种牡丹活体植株挥发性成分的检测方法，所述检测方法从花香样品采集方法和气相色谱-质谱条件等方面进行优化，能够比较真实地反映牡丹花挥发性成分及相对含量，适合在近自然条件下多种品种牡丹花挥发性成分的定性与定量分析。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种牡丹活体植株挥发性成分的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、制作吸附管：取一支外径4-6mm、长80-100mm的玻璃空管，清洗干净，烘干；将脱活玻璃毛塞入所述玻璃空管中，填充入40-60mm³的tenaxta吸附剂，然后依次用100-200μl无水乙醇、100-200μl二氯甲烷和100-200μl正戊烷清洗，制成吸附管；

步骤二、选取生长健壮、长势一致、花朵大小适中的牡丹花，分别罩上两端开口、无味透明的采样袋；在所述采样袋上端插入一支活性炭管、下端插入一支步骤一制作的吸附管，所述采样袋上端和下端分别以塑料卡条密封；

步骤三、将qc-1s型大气采样仪架在合适的位置，调整高度，进气口处连接一个玻璃y管，所述一个玻璃y管包括一个下管口和两个分支管口；所述下管口通过无味透明的硅胶管与进气口连接；调整大气采样仪的各项参数，控制流速为300-600ml/min，收集时间为2-4h；

步骤四、将玻璃y管的两个分支管口分别与牡丹花下端的吸附管通过无味透明的硅胶管相连，打开大气采样仪，开始采样；

步骤五、采样完毕后，取下吸附管，用保鲜膜密封，然后用锡箔纸包裹，置于超低温冰盒带回实验室，完成样品收集；

步骤六、向吸附管中加入正己烷500-1000μl，把吸附管垂直插入洁净的棕色进样瓶中，用洗耳球在吸附管上端开口反复抽打使得正己烷洗脱吸附管内的吸附剂，得到洗脱液；

步骤七、以氮气吹洗洗脱液，使之浓缩至100-200μl，置于-20℃冰箱保存，待用；

步骤八：打开气质联用仪，设定气相色谱-质谱条件，进样进行检测。

作为对上述方案的进一步优化，步骤八所述气相色谱-质谱条件分为气相色谱条件和质谱条件；

所述气相色谱条件为：hp-5ms弹性石英毛细管柱；柱流量：0.8ml/min；柱温：初温70℃，以6℃/min的速率升温到160℃，再以2℃/min的速率升温到180℃，然后以5℃/min的速率升温到250℃，保持10min；进样口温度250℃；载气：高纯氦气，流速0.8ml/min；进样方式：分流进样；进样量：5μl；

所述质谱条件为：ei源：70ev；接口温度：250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；em电压1247v；扫描范围29-450amu。

有益效果：

1、本发明选择的动态顶空吸附法作为一种活体植株挥发性成分的收集方法，首次在牡丹上使用。该方法可有效地解决传统离体测定方法检测牡丹花香成分的三个弊端：一是牡丹花瓣受损后部分挥发性成分会快速挥发，使得香气成分改变；二是采集到的样品必须在短期内快速测定，无法长时间保存；三是无法同时进行大量的样品采集。本发明所述方法携带方便、操作简单、成本较低、容易实现。牡丹株型较大，根系复杂，花期较短，故而难以将活体植株带回实验室进行取样，采取本方法只需携带大气采样仪、采样袋及各种玻璃制品到试验地，即可同时对多株牡丹进行实地采样，且仪器轻便，采样位置可以随时更换。采集到的样品可以在-20℃冰箱保存3-6个月。

2、牡丹花朵较大且香气适中，采样时间过长或过短都会造成样品效果不理想。本发明采样时间合理，适合牡丹花香样品的采集。

3、本发明所用的吸附管是自制的，使用前无需用活化仪等仪器进行活化，节省时间，节约成本，使用过后即可将吸附剂取出扔掉，玻璃管清洗后可再次使用，方便快捷，操作简单，极易实现。

4、检测技术为气相色谱-质谱技术，在该气相色谱-质谱条件下‘凤丹’牡丹、‘春归华屋’牡丹等牡丹品种的花香样品中多种挥发性成分之间可完全分离，且能够准确测出各种成分的相对含量，稳定性好，准确度高，适合采用动态顶空吸附法收集的牡丹花香样品的检测，可应用于多种牡丹品种中挥发性成分的定性与定量分析。

附图说明

图1是牡丹活体植株挥发性成分的收集方法即动态顶空吸附法的示意图；其中，a代表活性炭管，b代表采样袋，c代表吸附管，d代表硅胶管，e代表玻璃y管，f代表大气采样仪，g代表大气采样仪进气口，h代表大气采样仪出气口，i代表气流方向；

图2是‘凤丹’牡丹花香样品的总离子流图；其中横坐标为时间，纵坐标为丰度；

图3是‘春归华屋’牡丹花香样品的总离子流图；其中横坐标为时间，纵坐标为丰度。

具体实施方式

一种牡丹活体植株挥发性成分的收集方法，包括以下步骤：

步骤一：自制吸附管。取一支外径4-6mm、长80-100mm的玻璃吸附空管，清洗干净，烘干，用特制工具将脱活玻璃毛塞入玻璃空管中，填充入40-60mm³的tenaxta吸附剂后依次用100-200μl无水乙醇、100-200μl二氯甲烷和100-200μl正戊烷清洗吸附管。以同样的方法制作足够数量的吸附管，放置于阴凉干燥处待用。

步骤二：选取生长健壮、长势一致、花朵大小适中的牡丹花，如图1所示，在选取的活体牡丹花上分别罩上两端开口、无味透明的采样袋，在采样袋上端插入一支活性炭管、下端插入一支吸附管，然后分别以塑料卡条密封。

步骤三：将qc-1s型大气采样仪架在合适的位置，调整高度，进气口一端用无味透明的硅胶管连接一个定制的玻璃y管。调整大气采样仪的各项参数，控制流速为300-600ml/min，收集时间为2-4h。

步骤四：用无味透明的硅胶管将玻璃y管的两个分支与牡丹花下端的吸附管相连。打开大气采样仪，开始采样。采样中，大气采样仪开始工作，气流由采样袋流向进气口，采样袋内的空气持续输出并流经吸附管，活体牡丹花散发的挥发性物质被吸附管内的吸附剂吸附，在采样袋内的空气持续流出的同时，又通过采样袋上端的活性炭管口的空气持续补充，活性炭管内的活性炭能够除掉空气中的水分以及灰尘，以免影响后续吸附剂对牡丹花挥发性气味物质的吸附效果。

步骤五：采样完毕后，用保鲜膜密封吸附管，然后用锡箔纸包裹，置于超低温冰盒带回实验室。

步骤六：收集完成后，向吸附管中加入正己烷500-1000μl，把吸附管垂直插入洁净的棕色进样瓶中，用洗耳球在吸附管上端开口反复抽打使得正己烷洗脱吸附管内的吸附剂，得到洗脱液。

步骤七：以氮气吹洗洗脱液，使之浓缩至100-200μl。将样品置于-20℃冰箱保存，直至进行仪器分析时取出。

步骤八：打开气质联用仪（agilent6890/5973n），设定气相色谱-质谱条件。手动进样进行检测。（1）气相色谱条件：hp-5ms(0.25mm×30m，0.25μm)弹性石英毛细管柱；柱流量：0.8ml/min；柱温：初温70℃，以6℃/min的速率升温到160℃，再以2℃/min的速率升温到180℃，然后以5℃/min的速率升温到250℃，保持10min；进样口温度250℃；载气：高纯氦气，流速0.8ml/min；进样方式：分流进样；进样量：5μl。（2）质谱条件：ei源：70ev；接口温度：250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；em电压1247v；扫描范围29-450amu。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

步骤一：自制吸附管。取一支外径4-6mm、长80-100mm的玻璃吸附空管，清洗干净，烘干，用特制工具将脱活玻璃毛塞入玻璃空管中，填充入40-60mm³的tenaxta吸附剂后依次用100-200μl无水乙醇、100-200μl二氯甲烷和100-200μl正戊烷清洗吸附管。以同样的方法制作足够数量的吸附管，放置于阴凉干燥处待用。

步骤二：选取两朵植株生长健壮、长势一致、花朵大小适中的十年生‘凤丹’牡丹花，分别罩上两端开口、无味透明的采样袋。采样袋上端插入一支活性炭管，下端插入一支自制的吸附管，分别以塑料卡条密封。

步骤三：将qc-1s型大气采样仪架在合适的位置，调整高度，进气口一端用无味透明的硅胶管连接一个定制的玻璃y管。调整大气采样仪的各项参数，控制流速为300-600ml/min，收集时间为2-4h。

步骤四：用无味透明的硅胶管将玻璃y管的两个分支与两朵牡丹花下端的吸附管相连。打开大气采样仪，开始采样。

步骤五：采样完毕后，用保鲜膜密封吸附管，然后用锡箔纸包裹，置于超低温冰盒带回实验室。

步骤六：收集完成后，向吸附管中加入正己烷500-1000μl，把吸附管垂直插入洁净的棕色进样瓶中，用洗耳球在吸附管上端开口反复抽打使得正己烷洗脱吸附管内的吸附剂，得到洗脱液。

步骤七：以氮气吹洗洗脱液，使之浓缩至100-200μl。将样品置于-20℃冰箱保存，直至进行仪器分析时取出。

步骤八：打开气质联用仪（agilent6890/5973n），设定气相色谱-质谱条件。手动进样进行检测。（1）气相色谱条件：hp-5ms(0.25mm×30m，0.25μm)弹性石英毛细管柱；柱流量：0.8ml/min；柱温：初温70℃，以6℃/min的速率升温到160℃，再以2℃/min的速率升温到180℃，然后以5℃/min的速率升温到250℃，保持10min；进样口温度250℃；载气：高纯氦气，流速0.8ml/min；进样方式：分流进样；进样量：5μl。（2）质谱条件：ei源：70ev；接口温度：250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；em电压1247v；扫描范围29-450amu。

检测结果：通过质谱库检索和人工图谱解析，初开期的‘凤丹’牡丹中鉴定出23种主要的化合物，分别为罗勒烯、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、1，3，5-三甲氧基苯、十五烷、1-十六烯、十六烷、顺-7-十二烯-1-醇醋酸酯、8-十七烯、十七烷、1-十八烯、十八烷、十九烷、邻苯二甲酸二丁酯、反-5-二十烯、棕榈酸异丙酯、二十二烷、二十三烷、二十四烷、二十五烷、二十六烷，其中烷烃类14个、烯烃类5个、酯类3个、其它化合物1个。十一烷、十二烷、顺-7-十二烯-1-醇醋酸酯、邻苯二甲酸二丁酯、反-5-二十烯、棕榈酸异丙酯、二十六烷为首次在‘凤丹’中测出。相对含量：烷烃类化合物>酯类化合物>烯烃类化合物>其它化合物。烷烃类化合物中以十五烷的相对含量最高，为5.245%；酯类化合物中以顺-7-十二烯-1-醇醋酸酯的相对含量最高，为1.989%；烯烃类化合物中8-十七烯相对含量最高，为1.454%。

实施例2

步骤一：自制吸附管。取一支外径4-6mm、长80-100mm的玻璃吸附空管，清洗干净，烘干，用特制工具将脱活玻璃毛塞入玻璃空管中，填充入40-60mm³的tenaxta吸附剂后依次用100-200μl无水乙醇、100-200μl二氯甲烷和100-200μl正戊烷清洗吸附管。以同样的方法制作足够数量的吸附管，放置于阴凉干燥处待用。

步骤二：选取两朵植株生长健壮、长势一致、花朵大小适中的十年生‘春归华屋’牡丹花，分别罩上两端开口、无味透明的采样袋。采样袋上端插入一支活性炭管，下端插入一支自制的吸附管，分别以塑料卡条密封。

步骤三：将qc-1s型大气采样仪架在合适的位置，调整高度，进气口一端用无味透明的硅胶管连接一个定制的玻璃y管。调整大气采样仪的各项参数，控制流速为300-600ml/min，收集时间为2-4h。

步骤四：用无味透明的硅胶管将玻璃y管的两个分支与两朵牡丹花下端的吸附管相连。打开大气采样仪，开始采样。

步骤五：采样完毕后，用保鲜膜密封吸附管，然后用锡箔纸包裹，置于超低温冰盒带回实验室。

步骤六：收集完成后，向吸附管中加入正己烷500-1000μl，把吸附管垂直插入洁净的棕色进样瓶中，用洗耳球在吸附管上端开口反复抽打使得正己烷洗脱吸附管内的吸附剂，得到洗脱液。

步骤七：以氮气吹洗洗脱液，使之浓缩至100-200μl。将样品置于-20℃冰箱保存，直至进行仪器分析时取出。

步骤八：打开气质联用仪（agilent6890/5973n），设定气相色谱-质谱条件。手动进样进行检测。（1）气相色谱条件：hp-5ms(0.25mm×30m，0.25μm)弹性石英毛细管柱；柱流量：0.8ml/min；柱温：初温70℃，以6℃/min的速率升温到160℃，再以2℃/min的速率升温到180℃，然后以5℃/min的速率升温到250℃，保持10min；进样口温度250℃；载气：高纯氦气，流速0.8ml/min；进样方式：分流进样；进样量：5μl。（2）质谱条件：ei源：70ev；接口温度：250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；em电压1247v；扫描范围29-450amu。

检测结果：通过质谱库检索和人工谱图解析，初开期的‘春归华屋’牡丹中鉴定出22种主要的化合物，分别为对二甲氧基苯、十二烷、反-2-十四烯、十四烷、十五烷、苯酚2,4-双（1,1-二甲基）、顺-7-十六烯、十六烷、顺-7-十二烯-1-醇醋酸酯、8-十七烯、十七烷、反-3-十八烯、十八烷、十九烷、邻苯二甲酸二丁酯、反-5-二十烯、二十烷、1-二十二烯、二十二烷、二十四烷、二十五烷、邻苯二甲酸二异辛酯，其中烷烃类11个、烯烃类6个、酯类3个、其它化合物2个。相对含量：烷烃类化合物>烯烃类化合物>酯类化合物>其它化合物。烷烃类化合物中以十六烷的相对含量最高，为6.355%；烯烃类化合物中以反-3-十八烯的相对含量最高，为6.297%；酯类化合物中顺-7-十二烯-1-醇醋酸酯相对含量最高，为6.547%。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。