一种盐酸尼卡地平葡萄糖注射液中5-羟基甲基糠醛杂质和杂质I的检测方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种盐酸尼卡地平葡萄糖注射液中5-羟基甲基糠醛杂质和杂质i的检测方法。

背景技术：

盐酸尼卡地平主要抑制心肌与血管平滑肌的胯膜钙离子内流，但不会改变血钙浓度，其葡萄糖注射液临床适用于手术时异常心绞痛和高血压的急救处置，本品在降压的同时可显著改善患者的心、肾功能且不影响心率。

盐酸尼卡地平类注射剂见光易分解，生成无药理活性的尼卡地平降解杂质i；另外葡萄糖类注射剂易由葡萄糖原料引入的毒性杂质5-羟甲基糠醛。它易由己糖(葡萄糖、果糖等单糖)与氨基酸在高温、酸性条件或微生物的作用下脱水而生成，并会对人体横纹肌及内脏产生损害。

盐酸尼卡地平葡萄糖注射液为药典收载品种，现行国家药品标准——《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版二部，其有关物质项目与人用药品注册技术要求国际协调会(ich)分别制订的原料药、制剂杂质研究指导原则(ichq3a，ichq3b)要求有较大差距，除了未控制降解杂质i和毒性杂质5-甲基糠醛之外，标准单个杂质(降解杂质和副产物杂质)和总杂质限度分别为2.0％和4.0％，这对于药品注射剂的安全性来说过于宽松，对患者用药产生较大的安全风险。

技术实现要素：

为了解决现行国家标准分析方法中缺少对5-羟基甲基糠醛和杂质i等有关物质的控制和检测的实际问题，本发明提供了一种盐酸尼卡地平葡萄糖注射液相关上述毒性杂质的检测方法。

本发明提供的盐酸尼卡地平葡萄糖注射液中5-羟基甲基糠醛杂质和杂质i等有关物质的检测方法，采用离子对双波长高效液相色谱法进行测定，色谱条件如下：

色谱柱：采用c18硅烷键和硅胶为固定相；

流动相：离子对3.4g·l^-1硫酸四丁基氢铵溶液-甲醇-乙腈(60:30:10)；其中硫酸四丁基氢铵是离子对试剂。

检测波长：5-羟甲基糠醛为284nm、杂质i等有关物质为236nm；

柱温箱温度：35℃；

流速：1.0ml·min^-1；

进样量：20μl。

优选地，所述色谱柱为：kromasil100-5c18(250mm×4.6mm)。

优选地，所述检测方法的5-羟甲基糠醛的检测限为0.002μg·ml^-1；盐酸尼卡地平杂质ⅰ的检测限为0.05μg·ml^-1；盐酸尼卡地平的检测限为0.03μg·ml^-1。

优选地，所述检测方法的5-羟甲基糠醛的定量限为0.007μg·ml^-1；盐酸尼卡地平杂质ⅰ的定量限为0.15μg·ml^-1；盐酸尼卡地平的定量限为0.10μg·ml^-1。

优选地，避光操作取盐酸尼卡地平葡萄糖注射液。

优选地，所述检测方法，包括以下步骤：

(1)样品制备

精密称取5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平各适量分别至量瓶中，用流动相稀释至刻度；再各精密量取适量至容量瓶中，用流动相稀释成混合对照品储备溶液；

分别精密量取上述混合对照品储备液适量，用流动相稀释至刻度，制成不同质量浓度作为对照品溶液；

避光操作，取盐酸尼卡地平葡萄糖注射液为供试品溶液；

(2)标准曲线绘制

将上述对照品溶液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以对照品溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线并列出校准曲线的数学方程和线性范围；

(3)检测

将供试品溶液精密进样注入高效液相色谱仪，得到供试品色谱峰面积；

(4)计算

将供试品色谱峰面积代入上述标准曲线计算含量。

所述杂质i等有关物质包括降解杂质和副产物杂质。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

现有标准对于药品注射剂的安全性来说过于宽松，对患者用药产生较大的安全风险。本文建立了hplc离子对色谱法，以杂质对照品比较与自身对照相结合，双波长同时测定降解杂质i和特定杂质5-羟甲基糠醛的质量控制方法，操作简便、结果准确，取得了满意的结果。

本发明采用离子对双波长高效液相色谱法，能够一次同时测定5-羟基甲基糠醛和盐酸尼卡地平杂质i等有关物质杂质，实现了不同类别杂质同时测定，具有极简便的优势。

离子对硫酸四丁氢铵3.4g·l^-1硫酸四丁基氢铵溶液-甲醇-乙腈(60:30:10)(体积比)流动相很好的解决了盐酸盐类药物在抑制色谱法中，流动相低ph值条件也不能很好实现的色谱理论踏板数低的问题，大幅提高了柱效和进样柱载量。

本发明采用离子对色谱法，硫酸四丁基氢铵溶液-甲醇-乙腈(60:30:10)流动相克服了抑制色谱法对于盐酸盐类药物需要较低ph值的苛刻条件，同时硫酸四丁基氢铵又不同于一般的庚磺酸钠类的离子对，它便于清洗，能很好的与水、甲醇、乙腈等极性或有机溶剂混合，极大了延长了色谱柱的寿命。

本发明可以修正国家标准不足，能够起到完善标准，促进国家标准提升的目的作用。

本发明涉及基金项目为：陕西省社会科学发展基金资助项目(编号：2018sf-100)。

附图说明

图1是对照品溶液在236nm下的高效液相色谱分析图谱。

图2是对照品溶液在284nm下的高效液相色谱分析图谱。

图3是空白溶液在236nm下的高效液相色谱分析图谱。

图4是空白溶液在284nm下的高效液相色谱分析图谱。

图5是供试品溶液在236nm下的高效液相色谱分析图谱。

图6是供试品溶液在284nm下的高效液相色谱分析图谱。

图7是供试品溶液按照2015版药典方法测定的高效液相色谱分析图谱。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详述，但本发明的实施方式不限于此。本发明的实施例仅用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制。

本检测方法为药典规定的标准曲线法，以下实验过程和试验方法未详细说明的，均采用标准操作流程，例如溶液配制、系统适应性试验的操作方法。

仪器：

高效液相色谱仪：安捷伦1260高效液相色谱仪；dad二极管阵列检测器；梅特勒ae240电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

试药：

盐酸尼卡地平葡萄糖注射液(a制药有限公司a121、a131、a141)盐酸尼卡地平(00586-201102)、盐酸尼卡地平杂质ⅰ对照品(101184-202201)、5-羟甲基糠醛(111626-201509)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯tedia)；水为高纯水；硫酸四丁基氢铵(色谱纯)；供试注射剂均为各生产厂家提供。

色谱条件(采用离子对双波长高效液相色谱法)如下：

色谱柱：kromasil100-5c18(250mm×4.6mm)；

流动相：0.34％四丁基硫酸氢铵溶液-甲醇-乙腈(60:30:10)(体积比)；

检测波长：5-羟甲基糠醛为284nm、杂质i等有关物质为236nm；

柱温箱温度：35℃；

流速：1.0ml·min^-1。

进样量：20μl

实施例1：

(1)样品制备

精密称取5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平各约20mg分别至100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度；再各精密量取5ml至20ml容量瓶中，用流动相稀释成混合对照品储备溶液(质量浓度各约为50μg·ml^-1)；

分别精密量取上述混合对照品储备液适量，用流动相稀释至刻度，制成质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10和20μg·ml^-1作为对照品溶液；

避光操作，取盐酸尼卡地平葡萄糖注射液为供试品溶液；

(2)标准曲线绘制

将上述对照品溶液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制校准曲线并列出校准曲线的数学方程和线性范围；

(3)检测

精密进样20μl，注入高效液相色谱仪，得到供试品色谱峰面积；

(4)计算

将供试品色谱峰面积代入上述标准曲线计算含量。

测定的色谱图如图1-7所示。图1是对照品溶液在236nm下的高效液相色谱分析图谱。图2是对照品溶液在284nm下的高效液相色谱分析图谱。图3是空白溶液在236nm下的高效液相色谱分析图谱。图4是空白溶液在284nm下的高效液相色谱分析图谱。图5是供试品溶液在236nm下的高效液相色谱分析图谱。图6是供试品溶液在284nm下的高效液相色谱分析图谱。图7是供试品溶液按照2015版药典方法测定的高效液相色谱分析图谱。

通过比对色谱图，杂质确定：根据盐酸尼卡地平葡萄糖注射液5-羟基甲基糠醛及盐酸尼卡地平杂质i等有关物质检测图谱中对照品峰杂质分别为5-羟基甲基糠醛和盐酸尼卡地平杂质i。

含量测定结果见表1。

表1测定结果表

从表1可以看出，在该检测系统中，两种毒性杂质能被有效的检出，检测灵敏度5-羟甲基糠醛能够达到0.002μg·ml^-1和盐酸尼卡地平杂质i能够达到0.05μg·ml^-1。

实施例2方法学考察

对盐酸尼卡地平葡萄糖注射液中5-甲基糠醛和盐酸尼卡地平杂质i的检测方法进行了专属性、线性、精密度、重复性、准确性、稳定性、检出限和定量限等方法学考察。具体考察方法为：

(1)线性关系考察

精密称取5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平各约20mg分别至100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度。再各精密量取5ml至20ml容量瓶中，用流动相稀释成混合对照品储备溶液(质量浓度各约为50μg·ml^-1)。

分别精密量取上述混合对照品储备液适量，用流动相稀释至刻度，制成质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10和20μg·ml^-1作为对照品线性溶液。

按照实施例1项下色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)进行线性回归。5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平的线性考察结果见表2：

表2线性考察表

由表2可见：线性范围均为：0.1～20μg·ml^-1。5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平在线性范围内呈良好的线性关系。

(2)检出限及定量限

取对照品溶液，用流动相稀释到适宜质量浓度，以信噪比10:1时的进样量为定量限，以信噪比3:1时的进样量为检测限。

结果：在上述色谱条件下，当进样体积为20μl时，5-羟甲基糠醛检测限为0.002μg·ml^-1，定量限为0.007μg·ml^-1；盐酸尼卡地平杂质ⅰ检测限为0.05μg·ml^-1，定量限为0.15μg·ml^-1；盐酸尼卡地平检测限为0.03μg·ml^-1，定量限为0.10μg·ml^-1。

(3)精密度

取线性实验项下质量浓度为0.5、1.0、5.0μg·ml^-1的对照品溶液，在上述色谱条件下各进样3次，进样量20μl，记录峰面积，计算rsd值。

结果：5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平的rsd值分别为0.19％，0.73％和0.26％(n＝6)。表明仪器的精密度良好。

(4)重复性

取线性实验项下质量浓度为1.0μg·ml^-1的对照品溶液，避光重复进样6次测定。

结果：5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平的rsd值分别为0.24％，0.56％和0.72％(n＝6)。

(5)稳定性

取线性实验项下质量浓度为1.0μg·ml^-1的对照品溶液，在上述色谱条件项下于0、2、6、8、12和24h，避光进样测定。

结果：5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平的rsd值分别为0.16％，0.88％和0.52％(n＝9)。表明5-羟甲基糠醛、盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平在避光条件下24h内稳定。

(6)加样回收实验

取已知5-羟基糠醛含量的10％葡萄糖溶液供试品(批号a145)9份，每3份一个浓度水平加入5-羟基糠醛、盐酸尼卡地平杂质i和盐酸尼卡地平，使其浓度约为1.0、5.0、10μg·ml^-1，按上述色谱条件所述方法进行测定，计算回收率，结果见表3。

表3加样回收实验结果表

(7)专属性实验

取线性关系项下对照品溶液，在前述色谱条件下测定。结果表明，盐酸尼卡地平杂质ⅰ和盐酸尼卡地平均能有效分离(分离度：4.0)；5-羟甲基糠醛和空白溶剂峰分离度符合要求。色谱图见图1-6。

ich指导原则杂质控制指导原则(q3a)和《中国药典》2015年版附录杂质研究指导原则，都要求药品应对降解杂质、特殊毒性杂质进行限量控制,(0.1％)。2017年6月我国已经被人用药品注册技术要求国际协调会(ich)正式纳入为其成员国，在药品研发、质量标准提升和确保用药安全，存在的不足都亟待改进，以尽快适应国际竞争的需要。而现行《中国药典》2015年版二部盐酸尼卡地平葡萄糖注射液标准及降解杂质、五羟甲基糠醛的控制缺失以及杂质总量过高等问题也应引起高度重视，由于原自身对照杂质测定法，测定杂质i会使得杂质i的实际含量偏低近一倍，因此前期本发明人已经研究并制备了盐酸尼卡地平杂质i对照品，并对国家标准原料药杂质限度予以修订，因此盐酸尼卡地平葡萄糖注射液的国家标准理应及时跟进修订，以确保患者用药的安全性，提高企业产品质量。

《中国药典》2015年版二部中采用磷酸盐缓冲液为流动相的抑制色谱法(未规定ph值)对于盐酸尼卡地平(强酸弱碱性药物)来说是不适宜的，一方面低的ph值对于抑制色谱的柱效贡献较大，但又会对色谱保留行为和色谱柱寿命产生较大影响，同时变化的ph会导致杂质色谱峰与主成分峰出峰顺序的变化。而采用硫酸四丁基氢铵离子对双波长法不但能简便的同时测定5-羟基糠醛和降解杂质i等有关物质，而且能大幅提高色谱柱效、增加降解杂质i与主成分峰的分离度，使得系统适用性大幅改善；同时该离子对试剂能和高比例有机相进行混合梯度洗脱，而不会发生损害色谱柱寿命的堵塞现象，较磷酸盐缓冲液体系具有独特的优势。

二氢吡啶类药物见光易产生降解杂质，注射液更要注意这个问题，市场上市售的盐酸尼卡地平葡萄糖注射液均采用了透明包装材料，在生产、运输、贮藏和使用过程中，很难避免降解杂质的产生，同时《中国药典》2015年版二部中该品种有关物质测定方法采用了主成分自身对照法^[20]，这对于盐酸尼卡地平杂质i来说，使得实际结果偏低约一倍，因此中国药典该品种检测方法应尽快予以修订。

本发明可以修正国家标准不足，能够起到完善标准，促进国家标准提升的目的作用。

基于以上发明内容的描述，本领域技术人员能够全面地应用本发明，所有相同原理或类似的改动均应视为包括在本发明的范围之内。