一种同时测定皮肤角质层贴片中PCA、t-UCA的分析方法与流程

本发明属于分析检测
技术领域：
，涉及一种测定皮肤角质层贴片中pca、t-uca的分析方法，实现了在同一色谱条件下pca和t-uca与溶剂峰及皮肤中其它成分的分离，在较短时间内对pca和t-uca进行准确测定。
背景技术：
：吡咯烷酮羧酸(pca)是一种具有优良吸湿性能的天然保湿剂，作为自然保湿因子的最重要的成分大量存在于皮肤角质层中。尿刊酸是组氨酸的代谢产物，以反式(t-uca)存在于皮肤角质层中，其作为一种紫外吸收剂，对皮肤可以起到一定的防护作用。检测皮肤角质层中的pca和t-uca，可以更好的了解皮肤状态，帮助化妆品企业开发出更有针对性的产品。中国专利申请cn108982716a公开了一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其提取方法较为复杂，测定pca和uca的方法中，pca出峰时间过早，容易与溶剂峰重叠造成测定不准确。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能够同时快速、准确测定皮肤角质层贴片中pca和t-uca的方法，可用于了解皮肤状态及针对性皮肤产品的开发。为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种同时测定皮肤角质层贴片中pca、t-uca的分析方法，用稀释剂对皮肤角质层贴片进行前处理后离心取上清液，采用反相高效液相色谱法，用苯基键合硅胶色谱柱，甲醇-磷酸二氢钾溶液为流动相进行等度洗脱。所述方法中，前处理稀释剂为磷酸二氢钾溶液，浓度为0.02mol/l，含庚烷磺酸钠5mmol/l，磷酸调节ph至2.5。所述流动相组成为甲醇-磷酸二氢钾溶液(3:97)，其中磷酸二氢钾溶液中含5mmol/l庚烷磺酸钠，磷酸二氢钾浓度为0.02mol/l，ph值为2.5。所述的色谱柱为thermobetabasicphenyl，250×4.6mm，5μm。色谱条件包括：检测波长为210nm；流动相洗脱速率为1.0ml/min；色谱柱温度为20℃；样品进样量为20μl。本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明所述的同时测定皮肤角质层贴片中pca和t-uca的分析方法，前处理方法更为简便，分析时间更短，且可以实现在同一色谱条件下pca、t-uca与溶剂峰及其它皮肤成分色谱峰的较好分离，灵敏度高，重复性好，可用于皮肤角质层中pca、t-uca的准确测定。附图说明附图1对照品图谱附图2皮肤角质层贴片样品图谱附图3空白溶剂图谱附图4空白贴片图谱具体实施方式以下结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。综合考虑pca、t-uca的紫外吸收情况，本试验选择在两者吸收都较强的210nm处进行测定。试验发现，pca在c18柱上保留较差，调整流动相比例，改变缓冲盐类型，调整ph值以及加入离子对试剂后等措施均无法实现pca与溶剂峰的有效分离。考虑到苯基柱对有共轭体系的成分的选择性较好，改用苯基柱进行试验。加入离子对试剂并调整ph值，以达到尽量延长pca的保留时间，使其与溶剂峰及皮肤贴片的未知杂峰分离的同时，尽量缩短分析时间。实施例1pca、t-uca的高效液相色谱分析仪器与色谱条件高效液相色谱仪：agilent1260高效液相色谱系统及工作站。色谱柱：苯基键合硅胶色谱柱(thermobetabasicphenyl，250×4.6mm，5μm)。配制0.02mol/l的磷酸二氢钾溶液(含庚烷磺酸钠5mmol/l)，用磷酸调节ph值至2.5作为水相，流动相中甲醇-水相比例为3:97，设置流速为1.0ml/min，检测波长为210nm，柱温为20℃。实验步骤：分别精密称取pca和t-uca适量，用甲醇溶解并定容，配成各自的对照品储备液。分别量取储备液适量，用稀释剂稀释至每1ml含pca和t-uca各约5μg和1μg的混合对照溶液。取样品胶带1片，加稀释剂1ml，超声30min，离心取上清液，作为供试品溶液。按上述条件进行高效液相分析，进样20μl，色谱图详见说明书附图1和附图2。结果显示，保留时间约5min的为pca，保留时间约10min的为t-uca。实施例2本发明分析方法的方法学考察专属性考察取溶剂和空白胶带提取样品各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图详见说明书附图3、4。结果表明，溶剂和空白胶带提取样品在pca和t-uca出峰位置无干扰。检测限和定量限考察取混合对照品溶液，逐步稀释直至各成分的信噪比s/n接近3，作为检测限，逐步稀释直至各成分的信噪比s/n接近10，作为定量限。结果pca检测限为2.02ng，t-uca检测限为0.409ng，pca定量限为4.04ng，t-uca定量限为0.822ng。线性关系考察分别取pca和t-uca对照品储备液适量，稀释剂稀释至合适浓度，摇匀，作为混合对照品储备液。取混合对照品储备液逐级稀释，制成线性供试品溶液。分别量取20μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积a为纵坐标，浓度c为横坐标，进行线性回归，分别得回归方程。线性试验结果表明，pca在0.101μg/ml～25.235μg/ml范围内与其峰面积呈良好线性关系；t-uca在0.0205μg/ml～5.135μg/ml范围内与其峰面积呈良好线性关系。具体结果见表1。表1线性与范围重复性考察取空白胶带1张，置具塞离心试管中，加入适量对照品溶液，超声30min，离心取上清，得重复性供试品，同法制备6份。取重复性供试品和对照品20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算胶片中各待测成分含量，并计算rsd。胶带中pca含量的rsd为1.01％，t-uca含量的rsd为0.69％，试验结果见表2。由结果可知，本方法重复性良好。表2重复性试验结果123456rsd％pca0.0168％0.0166％0.0163％0.0166％0.0167％0.0165％1.01％t-uca0.00363％0.00357％0.00356％0.00361％0.00358％0.00360％0.69％中间精密度考察采用同样操作方法，由不同人员在不同高效液相色谱仪上重复上述试验，结果见表3。由结果可知，本方法重现性良好。表3中间精密度结果123456rsd％(n＝12)pca0.0168％0.0165％0.0163％0.0167％0.0165％0.0165％0.98％t-uca0.00361％0.00355％0.00351％0.00356％0.00357％0.00358％0.86％准确度考察取混合对照品储备液适量，分别用稀释剂稀释制成50％、100％、150％对照品溶液浓度的混合对照溶液。取空白胶带1张，置具塞离心管中，加入配制好的50％对照品溶液浓度的混合对照溶液1ml，超声30min后离心取上清，平行制备3份。同法制备100％和150％的回收率供试品。分别量取回收率供试品和对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算待测成分的回收率。结果见表4～5。由结果可知，本方法准确度良好。表4pca回收率试验结果表5t-uca回收率试验结果综上所述，本发明方法能够有效的分离皮肤提取物中pca、t-uca与其他成分和溶剂，能够准确、快速测定pca和t-uca，该方法简单、快速、准确、有效，精密度高。当前第1页12