高效定量检测细胞外囊泡中PD-L1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的方法、elisa试剂盒及使用方法。

背景技术：

我国每年新增恶性肿瘤患者430万人，死亡280万人，肿瘤已经成为我国死亡的最主要原因，是我国最主要的公共卫生问题之一。更让人深忧的是，恶性肿瘤患者的预后并未随着手术和放化疗技术的提高而得到明显改善。近来年快速兴起并斩获2018年诺贝尔奖的免疫疗法为恶性肿瘤患者带来了新的希望。其中针对免疫检查点程序性凋亡配体-1/程序性死亡受体-1(pd-l1/pd-1)的抑制剂是目前肿瘤免疫治疗的代表性药物，已经证实对多种恶性肿瘤具有明显疗效。然而，仅有不到30％的患者能够从pd-l1/pd-1免疫治疗中获益。而免疫治疗无效的患者不仅要承受高昂的治疗费用和免疫治疗副反应，还有可能因此错过接受其他治疗的时机。因此，当前迫切需要一种寻找能够精准预测免疫治疗疗效的生物标志物。

细胞外囊泡(extracellularvesicles,evs)是由细胞分泌的直径介于50-1000nm的脂质双分子层颗粒，其携带多种来源于母细胞的特征性生物信息分子，如蛋白质、核酸、脂类，甚至细胞器。近年来，体液中的细胞外囊泡作为液体活检的重要分支获得了广泛的关注。

本项目组近期研究发现肿瘤细胞可分泌pd-l1⁺的细胞外囊泡进入外周血，且肿瘤患者外周血中pd-l1⁺的细胞外囊泡水平及其在免疫治疗早期的变化趋势和幅度能够有效预测该患者对治疗的反应性。基于以上结果，我们前期提出了一种基于肿瘤患者外周血细胞外囊泡上pd-l1水平elisa检测策略。该elisa策略，以抗pd-l1抗体作为捕获抗体，将细胞外囊泡固定于elisa孔板中，利用抗pd-l1抗体来检测细胞外囊泡上的pd-l1水平，利用pd-l1标准蛋白对细胞外囊泡pd-l1水平进行定量。然而，患者体液中既存在细胞外囊泡上的pd-l1，还存在大量游离的pd-l1蛋白。显然，直接对体液样本进行pd-l1水平elisa检测，将受到游离pd-l1蛋白的干扰。因此，为了避免游离pd-l1的干扰，该策略需要预先利用超速离心法对体液中的细胞外囊泡进行分离和纯化。然而，超速离心法不仅耗时费力，缺乏标准化的操作流程，并且需要大型的超速离心设备，不利于临床推广应用；更重要的是，超速离心法分离细胞外囊泡的效率不足30％。这30％的细胞外囊泡中pd-l1的水平能否准确反映总细胞外囊泡中pd-l1水平目前仍然不清楚。

因此亟需发展一种可靠、快速并且经济的、可以直接高效定量检测体液中细胞外囊泡上pd-l1水平的方法。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的方法，避免了细胞外囊泡离心纯化这一步骤繁琐、样本回收率低的缺陷，同时还避免了游离pd-l1蛋白对检测结果的干扰，可实现特异性识别并定量检测细胞外囊泡中pd-l1的蛋白水平。

本发明的目的之二在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的elisa试剂盒，可以快速定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平。

本发明的目的之三在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的elisa试剂盒的使用方法。

本发明实现目的之一所采用的方案是：一种高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的方法，利用抗cd63抗体、抗cd9抗体或抗cd81抗体的特异性捕获细胞外囊泡，利用抗pd-l1抗体检测细胞外囊泡中pd-l1蛋白水平，利用构建的对应的cd63-pd-l1融合蛋白、cd9-pd-l1融合蛋白或cd81-pd-l1融合蛋白作为标准品实现对细胞外囊泡中pd-l1的定量检测。

优选地，所述cd63-pd-l1融合蛋白的核酸序列如seqidno：1所示，cd9-pd-l1融合蛋白的核酸序列如seqidno：2所示，cd81-pd-l1融合蛋白的核酸序列如seqidno：3所示。

优选地，所述细胞外囊泡来源于血液、唾液、尿液、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、汗液、精液、淋巴液、细胞培养上清中的任意一种。

除血液为针对全身各型癌症外，所采集的其余体液为针对所检测癌症的特异性部位液体，如针对口腔及邻近部位癌症的唾液、针对尿路上皮癌的尿液、针对肺癌的胸腔积液、针对脑胶质瘤的脑脊液等。

本发明实现目的之二所采用的方案是：一种高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的elisa试剂盒，包括elisa酶标板、封板膜、标准蛋白、标准蛋白稀释液、样品稀释液、浓缩洗涤液、酶标抗体a、酶标抗体b、显色剂a液、显色剂b液和终止液；

其中，所述elisa酶标板为按1-5μg/ml浓度提前包被好抗cd63抗体、抗cd9抗体或抗cd81抗体的酶标板；

所述标准蛋白对应为构建的cd63-pd-l1、cd9-pd-l1或cd81-pd-l1融合蛋白。

elisa酶标板为biolegend公司的nunc型号酶标板；封板膜为corning公司的封板膜，货号uc-500，所述标准蛋白稀释液包括缓冲液100-300mmol/l、稳定剂5-20g/l、防腐剂2-6g/l。

优选地，所述抗cd63抗体为thermofisher公司的抗cd63抗体，货号tj26539346；所述抗cd9抗体为thermofisher公司的抗cd9抗体，货号tl2686763；所述抗cd81抗体为novus公司的抗cd81抗体，货号531413。

优选地，所述cd63-pd-l1融合蛋白的核酸序列如seqidno：1所示，cd9-pd-l1融合蛋白的核酸序列如seqidno：2所示，cd81-pd-l1融合蛋白的核酸序列如seqidno：3所示。

优选地，所述浓缩洗涤液为含0.01-0.05mol/lpbs、质量百分数1‰-5‰的tween-20的水溶液；所述酶标抗体a为1μg/mlpd-l1检测抗体，所述酶标抗体b为1μg/ml辣根过氧化物酶耦联显色抗体。

本试剂盒提供的酶标抗体a为1μg/mlpd-l1检测抗体，为对市售多种pd-l1检测抗体筛选后，选择ebioscience公司的pd-l1抗体，货号13-5983-82。本试剂盒提供的酶标抗体b为1μg/ml辣根过氧化物酶耦联显色抗体，为对市售多种hrp显色抗体筛选后，选择bd公司的hrp显色抗体，货号554066。

优选地，所述显色剂a液按质量百分比计包括醋酸钠2.72％、柠檬酸0.32％、双氧水0.02％，配置于蒸馏水中；所述显色剂b液按质量百分比计包括乙二胺四乙酸二钠0.04％、柠檬酸0.19％、甘油9％、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺0.03％，配置于蒸馏水中；所述终止液为2mol/l稀硫酸。

本发明实现目的之三所采用的方案是：一种所述的高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的elisa试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)在室温条件下平衡后，取出elisa酶标板，在酶标板上设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度梯度的标准蛋白，样本孔中加入待测体液样本，37℃培养1小时；

(2)弃去孔内液体，注入洗涤液300μl，洗涤，重复多次，最后一次弃去洗涤液后倒置于吸水纸上拍干；

(3)在elisa酶标板孔加入100μl预先混合好的酶标抗体a液、酶标抗体b液，用封板膜封住酶标板孔，37℃孵育1小时；

(4)弃去孔内液体，注入洗涤液300μl，洗涤，重复多次，最后一次弃去洗涤液后倒置于吸水纸上拍干；

(5)将显色剂a液、显色剂b液按体积比1:1混合，每孔加入100μl，室温避光显色；

(6)观察标准品孔10-30分钟内出现颜色梯度改变后加入50μl终止液终止显色，轻轻摇动至孔内呈黄色，15分钟内分别在450nm和570nm波长处测定各孔od值，计算450nm处od值减去570nm处od值即为样品的最终od值，并计算待测样本浓度。

优选地，所述步骤(1)中，标准品浓度梯度为16ng/ml、12ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0ng/ml八个浓度梯度，每个标准孔加入100μl。

本发明在步骤1中所提及的体液样本需经过初步离心处理，针对不同体液主要有三种离心条件：一、对于唾液和其他粘稠体液，离心力2600g，离心温度4℃，离心时间15分钟，收集上清，共离心两次；二、对于血液，离心力1550g，离心温度25℃，离心时间20分钟，收集上方透明血浆，共离心两次；三，对于尿液等相对清亮体液，离心力1550g，离心温度4℃，离心时间15分钟，取上清，共离心两次。

本发明在步骤1和步骤3中设置的孵育温度为37℃，孵育时间为1小时。

本发明在步骤2和步骤4所提及的洗涤方法为，吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干。

本发明在步骤2到步骤6使用8或12道移液器加液，以减少操作误差和上样误差。

本发明步骤6所提及的od值为吸光度值，需要用450nm波长处的od值减去570nm波长处的od值进行校正，最终根据标准品的线性关系计算样本浓度。

本发明具有以下优点和有益效果：

已有研究表明，几乎所有的细胞外囊泡均表达四跨膜蛋白家族分子cd63、cd9、cd81，因此将cd63、cd9、cd81分子作为鉴定细胞外囊泡的标志物。基于此，本发明提出一种直接检测人体液或细胞培养上清中细胞外囊泡-pd-l1水平的检测新方法，采用“双抗夹心”法，即该方法以抗cd63抗体、抗cd9抗体或抗cd81抗体作为细胞外囊泡的捕获抗体，以抗pd-l1抗体作为检测抗体，以自主构建的cd63-pd-l1、cd9-pd-l1或cd81-pd-l1融合蛋白作为标准品，从而实现定量快速检测体液或细胞培养上清中细胞外囊泡的pd-l1含量。该方法与现有的以抗pd-l1抗体作为捕获抗体的elisa检测策略相比，避免了体液离心纯化这一繁琐步骤、样本回收率低的缺陷，同时还避免了游离pd-l1蛋白对检测结果的干扰，实现了特异性地识别并定量检测细胞外囊泡-pd-l1的蛋白水平。此外，由于并非每个细胞外囊泡都同时表达cd63、cd9和cd81，因此，通过组合和搭配不同的标志分子，可大大提高总细胞外囊泡的捕获效率，实现总细胞外囊泡的高效捕获。本方法将在恶性肿瘤的早期诊断、预后评估、免疫治疗疗效预测方面有着广阔的应用前景。

现有的pd-l1⁺细胞外囊泡定量检测需要经过对体液或细胞培养上清进行超速离心纯化获得细胞外囊泡，再经过elisa进行定量检测。本发明突破了传统的“a-a-a三明治”elisa检测游离单一蛋白分子的模式，利用“a-ab-b”策略对原有的检测方法进行升级，实现了对细胞外囊泡这一复杂结构的定量检测；同时，通过自主构建的cd63-pd-l1、cd9-pd-l1、cd81-pd-l1融合蛋白作为标准蛋白，使检测结果不再是百分含量，而是以具体的蛋白浓度进行表征。

附图说明

图1为本发明实施例四中正常细胞系(huvec)和癌症细胞系(cal27、h1975)细胞外囊泡粒径分布(a-c)；

图2为本发明实施例四中cd63-pd-l1重组蛋白标准曲线；

图3为本发明实施例四中正常细胞系(huvec)和癌症细胞系(cal27、h1975)的细胞上清(supernatant)、细胞外囊泡(evs)、超速离心后上清(evs-freesupernatant)elisa检测结果；

图4为本发明实施例五中wm164移植瘤裸鼠细胞外囊泡中pd-l1蛋白水平与肿瘤体积变化趋势；

图5为本发明实施例六中正常受试者(hd)、非小细胞肺癌患者(nsclc)、恶性黑色素瘤患者(mp)的血浆(plasma)、细胞外囊泡(evs)、超速离心后上清(evs-freeplasma)elisa检测结果；

图6为本发明实施例七中口腔癌患者的唾液经过抗cd63抗体、抗cd9抗体、抗cd81抗体、抗cd63/9/81混合抗体进行捕获后的elisa检测结果。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面的实施例是对本发明的进一步说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例一：cd63-pd-l1融合蛋白的构建

1.根据pubmedgene查询到人源cd63基因序列(geneid:967)，选取其中ala103到val203翻译片段；pd-l1基因序列(geneid:29126)，选取其中phe19到thr239翻译片段；在两段间插入一段连接蛋白序列(ggtggtggtggtagcggtggtggcggtagtggtggtggtggtagc)，在pd-l1尾端连接his标签片段(catcaccatcatcatcat)，引入ecorl、xhol双酶切位点，设计一对正反引物(表1)，进行pcr扩增获得cd63-pd-l1基因片段，其核酸序列见seqidno：1所示，其氨基酸序列见seqidno：4所示。

表1.cd63-pd-l1pcr引物

2.将cd63-pd-l1基因片段与经过ecorl、xhol双酶切后的pet28a质粒通过exnase重组酶(诺唯赞公司，货号c113-01)进行连接，经过转化筛选后得到重组质粒cd63-pd-l1。

3.将重组质粒cd63-pd-l1转入e.colidh5α感受态细菌中，经过kanamycin抗性的琼脂糖培养基(k⁺lb)大量扩增后，抽提质粒。

4.将抽提的重组质粒cd63-pd-l1转入rosetta(de3)感受态细菌中，均匀涂布于k⁺lb固态培养基获得目的克隆菌株。

5.挑选单菌落至50mlk⁺lb培养至od600＝0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.5-1mmol/l刺激蛋白表达，连续培养4-8小时，12000r/分钟离心15分钟分别收取上清和沉淀，经pbs稀释或重悬后每100μl加入20μl6×蛋白上样缓冲液，进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色分析鉴定。

6.将收取的细菌沉淀加入8ml细菌裂解液(tris-hcl50mmol/l，nacl300mmol/l，tritonx-1000.5％，ph＝8.0)，在冰上混合30分钟，在4℃12000g条件下离心10分钟，用15倍体积包涵体溶解缓冲液(tris-hcl50mmol/l，nacl100mmol/l，edta1mmol/l，tritonx-1000.5％，尿素8mol/l，ph＝8.0)重悬沉淀。

7.将以上重悬液加入10mmol/l咪唑后加入层析柱，控制流速0.5-1ml/分钟，以流速为1ml/分钟的洗涤缓冲液(tris-hcl50mmol/l；nacl300mmol/l；咪唑10mmol/l；ph＝8.0)洗涤柱子以去除杂蛋白，重复洗涤6次后使用洗脱缓冲液(tris-hcl50mmol/l；nacl300mmol/l；咪唑250mmol/l；ph＝8.0)分4次洗脱，收集洗脱液。

8.将收集到的洗脱液使用半透膜透析到pbs中，4℃透析过夜，收集到膜内溶液，获得即为cd63-pd-l1融合蛋白

实施例二：cd9-pd-l1融合蛋白的构建

1.根据pubmedgene查询到人源cd9基因序列(geneid:928)，选取其中ser112到ile195翻译片段；pd-l1基因序列(geneid:29126)，选取其中phe19到thr239翻译片段，在两段间插入一段连接蛋白序列(ggtggtggtggtagcggtggtggcggtagtggtggtggtggtagc)，在pd-l1尾端连接his标签片段(catcaccatcatcatcat)，引入ecorl、xhol双酶切位点，设计一对正反引物(表2)，进行pcr扩增获得cd9-pd-l1基因片段，其核酸序列见seqidno：2所示，其氨基酸序列见seqidno：5所示。

表2cd9-pd-l1pcr引物

2.将cd9-pd-l1基因片段与经过ecorl、xhol双酶切后的pet28a质粒通过exnase重组酶进行连接，经过转化筛选后得到重组质粒cd9-pd-l1。

3.将重组质粒cd63-pd-l1转入e.colidh5α感受态细菌中，经过k⁺lb培养基大量扩增后，抽提质粒。

4.将抽提的重组质粒cd9-pd-l1转入rosetta(de3)感受态细菌中，均匀涂布于k⁺lb固态培养基获得目的克隆菌株。

5.挑选单菌落至50mlk⁺lb培养至od600＝0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.5-1mmol/l刺激蛋白表达，连续培养4-8小时，12000r/分钟离心15分钟分别收取上清和沉淀，经pbs稀释或重悬后每100μl加入20μl6×蛋白上样缓冲液，进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色分析鉴定。

6.将收取的细菌沉淀加入8ml细菌裂解液(tris-hcl50mmol/l，nacl300mmol/l，tritonx-1000.5％，ph＝8.0)，在冰上混合30分钟，在4℃12,000g条件下离心10分钟，用15倍体积包涵体溶解缓冲液(tris-hcl50mmol/l，nacl100mmol/l，edta1mmol/l，tritonx-1000.5％，尿素8mol/l，ph＝8.0)重悬沉淀。

7.将以上重悬液加入10mmol/l咪唑后加入层析柱，控制流速0.5-1ml/分钟，以流速为1ml/分钟的洗涤缓冲液(tris-hcl50mmol/l；nacl300mmol/l；咪唑10mmol/l；ph＝8.0)洗涤柱子以去除杂蛋白，重复洗涤6次后使用洗脱缓冲液(tris-hcl50mmol/l；nacl300mmol/l；咪唑250mmol/l；ph＝8.0)分4次洗脱，收集洗脱液。

8.将收集到的洗脱液使用半透膜透析到pbs中，4℃透析过夜，收集到膜内溶液，获得即为cd9-pd-l1融合蛋白。

实施例三：cd81-pd-l1融合蛋白的构建

1.根据pubmedgene查询到人源cd81基因序列(geneid:975)，选取其中phe113到lys201翻译片段；pd-l1基因序列(geneid:29126)，选取其中phe19到thr239翻译片段；在两段间插入一段连接蛋白序列(ggtggtggtggtagcggtggtggcggtagtggtggtggtggtagc)，在pd-l1尾端连接his标签片段(catcaccatcatcatcat)，引入ecorl、xhol双酶切位点，设计一对正反引物(表3)，进行pcr扩增获得cd81-pd-l1基因片段，其核酸序列见seqidno：3所示，其氨基酸序列见seqidno：6所示。

表3.cd81-pd-l1pcr引物

2.将cd81-pd-l1基因片段与经过ecorl、xhol双酶切后的pet28a质粒通过exnase重组酶进行连接，经过转化筛选后得到重组质粒cd81-pd-l1。

3.将重组质粒cd81-pd-l1转入e.colidh5α感受态细菌中，经过k⁺lb培养基大量扩增后，抽提质粒。

4.将抽提的重组质粒cd81-pd-l1转入rosetta(de3)感受态细菌中，均匀涂布于k⁺lb固态培养基获得目的克隆菌株。

5.挑选单菌落至50mlk⁺lb培养至od600＝0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.5-1mmol/l刺激蛋白表达，连续培养4-8小时，12000r/分钟离心15分钟分别收取上清和沉淀，经pbs稀释或重悬后每100μl加入20μl6×蛋白上样缓冲液，进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色分析鉴定。

6.将收取的细菌沉淀加入8ml细菌裂解液(tris-hcl50mmol/l，nacl300mmol/l，tritonx-1000.5％，ph＝8.0)，在冰上混合30分钟，在4℃12000g条件下离心10分钟，用15倍体积包涵体溶解缓冲液(tris-hcl50mmol/l，nacl100mmol/l，edta1mmol/l，tritonx-1000.5％，尿素8mol/l，ph＝8.0)重悬沉淀。

7.将以上重悬液加入10mmol/l咪唑后加入层析柱，控制流速0.5-1ml/分钟，以流速为1ml/分钟的洗涤缓冲液(tris-hcl50mmol/l；nacl300mmol/l；咪唑10mmol/l；ph＝8.0)洗涤柱子以去除杂蛋白，重复洗涤6次后使用洗脱缓冲液(tris-hcl50mmol/l；nacl300mmol/l；咪唑250mmol/l；ph＝8.0)分4次洗脱，收集洗脱液。

8.将收集到的洗脱液使用半透膜透析到pbs中，4℃透析过夜，收集到膜内溶液，获得即为cd81-pd-l1融合蛋白。

实施例四：口腔癌和肺癌细胞系来源细胞外囊泡中pd-l1水平的elisa检测

1.使用无外泌体胎牛血清(100000g，4℃过夜离心)培养的人正常细胞系huvec、人口腔癌细胞系cal27以及人肺癌h1975细胞系，收集经过48h低浓度胎牛血清(5％)饥饿培养的细胞上清。

2.将收集的10ml细胞上清在4℃、2000g条件下离心30分钟，保留上清以除去细胞和细胞碎片，取1ml上清待检测，剩余9ml上清在4℃，100000g条件下离心70分钟，分别收集离心上清和以20μlpbs重悬沉淀获得细胞外囊泡。

3.将重悬得到的细胞外囊泡进行纳米粒子跟踪分析(nanoparticletrackinganalysis,nta)检测，发现huvec、cal27和h1975来源的细胞外囊泡平均粒径均在100nm左右(图1，a-c)。

4.取100μl上述huvec、cal27和h1975细胞系收集到的上清、细胞外囊泡(稀释20倍)、超速离心得到的上清加入已铺好cd63捕获抗体的酶标板样本孔，同时取实施例一中获得的cd63-pd-l1标准蛋白按照16ng/ml、12ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0ng/ml设置八个浓度梯度，每个标准品孔加入100μl，封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1小时。

5.操作步骤5的同时将酶标抗体a、b液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1小时。

6.弃去酶标板孔内液体，注入300μlpbst洗涤液(0.05％tween20的pbs溶液)，反复洗涤4次，倒置于吸水纸上拍干，加入100μl步骤6的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1小时。

7.弃去酶标板孔内液体，注入300μlpbst洗涤液，反复洗涤5次，倒置于吸水纸上拍干；将显色液a、b液按1:1混合，每孔加入100μl，避光显色。

8.待标准孔出现颜色线性改变后(10-30分钟)，每孔加入50μl终止液，轻轻摇动至孔内液体终止完全，15分钟内用酶标仪测定450nm和570nm波长处测定od值(450nm处od值减去570nm处od值即为样品的最终od值)。

9.根据标准品结果绘制标准曲线(图2)，计算各细胞系样品pd-l1浓度(图3)，结果显示：正常细胞系huvec的三种样本均几乎检测不到pd-l1，肿瘤细胞系cal27和h1975细胞上清和离心得到的细胞外囊泡结果相似，而超速离心后得到的上清中几乎无pd-l1，提示用本elisa试剂盒可以直接定量检测培养上清中evs上的pd-l1。

实施例五：一种高效定量检测细胞外囊泡pd-l1水平的elisa试剂盒在监测肿瘤进展中的应用

1.取对数期wm164细胞接种到8周龄裸鼠后背皮下，每只注射5×10⁶个细胞(100μl)，共接种20只；培养三周，拍照并测量肿瘤体积，肿瘤体积计算按照宽²×长/2进行计算。

2.对裸鼠行安乐死，立刻收集眼球动脉血500μl，25℃1550g条件下离心10分钟，收集上层血浆；同样条件下离心10分钟，收集上层血浆。

3.取出预先铺好cd63捕获抗体的酶标板，将实施例一中制备的cd63-pd-l1重组蛋白设置16ng/ml、12ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0ng/ml共8个浓度梯度，加入标准品孔；取100μl裸鼠血浆加入样本孔；封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1小时。

4.操作步骤3的同时将酶标抗体a、b液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1小时。

5.吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟后吸干孔内液体，重复洗涤4次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；加入100μl步骤3的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1小时。

6.吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟后吸干孔内液体，重复洗涤5次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；将显色液a、b液按1:1混合，每孔加入100μl，避光显色。

7.观察标准品孔10-30分钟内出现颜色梯度改变后加入50μl终止液终止显色反应，轻轻摇动至孔内终止完全，15分钟内于酶联免疫检测仪450nm和570nm波长处测定各孔od值，计算450nm处od值减去570nm处od值即为样品的最终od值，并计算待测样本浓度。

8.结合肿瘤测量结果，分析肿瘤体积与血液细胞外囊泡上pd-l1浓度的相关性(图4)。结果表明裸鼠血液内细胞外囊泡上pd-l1浓度随着肿瘤体积增大而增加(p＝0.0002)，提示体液中细胞外囊泡上pd-l1可以预测肿瘤的进展。

实施例六：一种高效定量检测人体液细胞外囊泡上pd-l1水平的elisa试剂盒在肿瘤诊疗中的应用

1.收集五例正常受试者(healthydonor,hd)、五例非小细胞肺癌(nsclc)患者、五例恶性黑色素瘤(melanomapatient,mp)患者的血液2ml，25℃1550g条件下离心10分钟，收集上层血浆；同样条件下离心10分钟，收集上层血浆；保留部分血浆检测用，剩余部分4℃16000g条件下离心10分钟，收集上清；4℃120000g条件下离心70分钟，收集上清并用20μlpbs重悬沉淀获得细胞外囊泡。

2.取100μl上述收集到的血浆、细胞外囊泡(稀释25倍)、超速离心得到的上清加入已预先铺好cd63捕获抗体的酶标板样本孔；将实施例一中制备的cd63-pd-l1重组蛋白设置16ng/ml、12ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0ng/ml共8个浓度梯度，加入标准品孔；封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1小时。

3.操作步骤3的同时将酶标抗体a、b液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1小时。

4.吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟后吸干孔内液体，重复洗涤4次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；加入100μl步骤3的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1小时。

5.吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟后吸干孔内液体，重复洗涤5次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；将显色液a、b液按1:1混合，每孔加入100μl，避光显色。

6.观察标准品孔10-30分钟内出现颜色梯度改变后加入50μl终止液终止显色反应，轻轻摇动至孔内终止完全，15分钟内于酶联免疫检测仪450nm和570nm波长处测定各孔od值，计算450nm处od值减去570nm处od值即为样品的最终od值，并计算待测样本浓度。

7.比较正常受试者、非小细胞肺癌患者、恶性黑色素瘤患者的血液样品pd-l1浓度(图5)。结果显示：三组样本中血浆和离心得到的细胞外囊泡结果相似，而超速离心后得到的上清中均检测不到pd-l1，进一步提示本elisa试剂盒可以排除游离pd-l1蛋白的干扰，定量检测培养上清中细胞外囊泡上的pd-l1；而非小细胞肺癌和恶性黑色素瘤两组患者的结果明显高于hd组，表明本试剂盒可以用于恶性肿瘤患者的诊断。

实施例七：一种高效定量检测细胞外囊泡上pd-l1水平的elisa试剂盒在检测口腔癌唾液细胞外囊泡pd-l1水平中的应用

1.收集五例口腔癌(oscc)患者的唾液各5ml，4℃2600g条件下离心15分钟，收集上清，共离心两次，保存于4℃条件下备用。

2.分别取抗cd63抗体(thermofisher，货号tj26539346)、抗cd9抗体(thermofisher，货号tl2686763)、抗cd81抗体(novus，货号531413)按照5μg/ml的浓度稀释于碳酸包被缓冲液中(8.4gnahco3、3.56gna2co3溶于1l双蒸水，调ph至9.5)，并取抗cd63、cd9、cd81抗体各按照5μg/ml浓度进行混合稀释作为体液总细胞外囊泡的捕获抗体。

3.elisa酶标板上每孔加入50μl上述抗cd63、cd9、cd81及cd63/9/81混合抗体，每组5孔，共20孔；封口膜封闭孔板，4℃条件下过夜。

4.吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟后吸干孔内液体，重复洗涤4次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干。

5.每孔加入200μl封闭液(10％fbs，2ml胎牛血清加入18mlpbs)，室温封闭1小时。

6.取100μl步骤1收集的上清加入到上述样本孔中，每位患者各设一未孵育捕获抗体的孔作为空白对照；封口膜封闭孔板，放入37℃温箱孵育1小时。

7.操作步骤6的同时将酶标抗体a、b液按照1:1混合，放入37℃温箱孵育1小时。

8.吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟后吸干孔内液体；重复洗涤4次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；加入100μl步骤3的酶标抗体混合液，放入37℃温箱孵育1小时。

9.吸净孔内反应液，注入洗涤液300μl，轻摇2分钟后吸干孔内液体；重复洗涤5次，最后一次需吸净孔内洗涤液，并倒置于吸水纸上拍干；将显色液a、b液按1:1混合，每孔加入100μl，避光显色。

10.观察样本孔10-30分钟内出现颜色改变后加入50μl终止液终止显色反应，轻轻摇动至孔内终止完全，15分钟内于酶联免疫检测仪450nm和570nm波长处测定各孔od值，计算450nm处od值减去570nm处od值即为样品的最终od值。

11.比较抗cd63、cd9、cd81、cd63/9/81混合抗体捕获后获得的检测结果(图6)，以cd63/9/81作为对照，可见使用cd9捕获抗体较cd63和cd81捕获抗体获得的pd-l1含量稍高，即使用抗cd9抗体捕获到更多的细胞外囊泡，而抗cd63/9/63混合捕获抗体较抗cd63、cd9和cd81抗体捕获到更多的细胞外囊泡和检测到更多的pd-l1，表明不同体液中细胞外囊泡的表面蛋白表达不同，而利用抗cd63/9/81混合捕获抗体可以避免因不同体液表面蛋白分子的表达差异而引起的误差。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

序列表

<110>武汉大学

<120>高效定量检测细胞外囊泡中pd-l1水平的方法、elisa试剂盒及使用方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1032

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcgggttatgtgtttcgtgataaagtgatgagtgaatttaataataattttcgccagcag60

atggaaaattatccgaaaaataatcataccgccagcattctggatcgtatgcaggccgat120

tttaaatgctgcggtgccgccaattataccgattgggaaaaaattccgagcatgagcaaa180

aatcgcgttccggattcatgctgtattaatgtgaccgttggctgcggcattaattttaat240

gaaaaagcgattcataaagaaggctgtgttgaaaaaattggtggttggctgcgcaaaaat300

gtgggtggtggtggtagcggtggtggcggtagtggtggtggtggtagctttaccgtgacc360

gtgccgaaagatctgtatgttgttgaatatggtagcaatatgacaattgaatgtaaattt420

ccggtggaaaaacagctggatctggcagcgctgattgtttattgggaaatggaagataaa480

aacattattcagtttgtgcatggtgaagaagatctgaaagtgcagcatagctcatatcgc540

cagcgtgcccgtctgctgaaagatcagctgagcctgggcaatgccgccttacagattacc600

gatgttaaattgcaggatgcgggtgtgtatcgttgcatgattagctatggtggcgcagat660

tataaacgcattaccgtgaaagttaatgcaccgtataataaaattaatcagcgtattctg720

gtggttgatccggtgacctccgaacatgaactgacctgccaggccgaaggctatccgaaa780

gccgaagtgatttggaccagcagcgatcatcaggtgctgagcggtaaaaccaccaccacc840

aatagcaaacgtgaagaaaaactgtttaatgttaccagcaccctgcgtattaataccacc900

accaatgaaatcttttattgcacctttcgccgtctggatccggaagaaaatcataccgca960

gaactggttattccggaactgccgctggcccatccgccgaatgaacgcacccatcaccat1020

catcatcattaa1032

<210>2

<211>981

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tcccacaaggatgaggtgattaaggaagtccaggagttttacaaggacacctacaacaag60

ctgaaaaccaaggatgagccccagcgggaaacgctgaaagccatccactatgcgttgaac120

tgctgtggtttggctgggggcgtggaacagtttatctcagacatctgccccaagaaggac180

gtactcgaaaccttcaccgtgaagtcctgtcctgatgccatcaaagaggtcttcgacaat240

aaattccacatcggtggtggtggtagcggtggtggcggtagtggtggtggtggtagcttt300

accgtgaccgtgccgaaagatctgtatgttgttgaatatggtagcaatatgacaattgaa360

tgtaaatttccggtggaaaaacagctggatctggcagcgctgattgtttattgggaaatg420

gaagataaaaacattattcagtttgtgcatggtgaagaagatctgaaagtgcagcatagc480

tcatatcgccagcgtgcccgtctgctgaaagatcagctgagcctgggcaatgccgcctta540

cagattaccgatgttaaattgcaggatgcgggtgtgtatcgttgcatgattagctatggt600

ggcgcagattataaacgcattaccgtgaaagttaatgcaccgtataataaaattaatcag660

cgtattctggtggttgatccggtgacctccgaacatgaactgacctgccaggccgaaggc720

tatccgaaagccgaagtgatttggaccagcagcgatcatcaggtgctgagcggtaaaacc780

accaccaccaatagcaaacgtgaagaaaaactgtttaatgttaccagcaccctgcgtatt840

aataccaccaccaatgaaatcttttattgcacctttcgccgtctggatccggaagaaaat900

cataccgcagaactggttattccggaactgccgctggcccatccgccgaatgaacgcacc960

catcaccatcatcatcattaa981

<210>3

<211>996

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tttgtcaacaaggaccagatcgccaaggatgtgaagcagttctatgaccaggccctacag60

caggccgtggtggatgatgacgccaacaacgccaaggctgtggtgaagaccttccacgag120

acgcttgactgctgtggctccagcacactgactgctttgaccacctcagtgctcaagaac180

aatttgtgtccctcgggcagcaacatcatcagcaacctcttcaaggaggactgccaccag240

aagatcgatgacctcttctccgggaagggtggtggtggtagcggtggtggcggtagtggt300

ggtggtggtagctttaccgtgaccgtgccgaaagatctgtatgttgttgaatatggtagc360

aatatgacaattgaatgtaaatttccggtggaaaaacagctggatctggcagcgctgatt420

gtttattgggaaatggaagataaaaacattattcagtttgtgcatggtgaagaagatctg480

aaagtgcagcatagctcatatcgccagcgtgcccgtctgctgaaagatcagctgagcctg540

ggcaatgccgccttacagattaccgatgttaaattgcaggatgcgggtgtgtatcgttgc600

atgattagctatggtggcgcagattataaacgcattaccgtgaaagttaatgcaccgtat660

aataaaattaatcagcgtattctggtggttgatccggtgacctccgaacatgaactgacc720

tgccaggccgaaggctatccgaaagccgaagtgatttggaccagcagcgatcatcaggtg780

ctgagcggtaaaaccaccaccaccaatagcaaacgtgaagaaaaactgtttaatgttacc840

agcaccctgcgtattaataccaccaccaatgaaatcttttattgcacctttcgccgtctg900

gatccggaagaaaatcataccgcagaactggttattccggaactgccgctggcccatccg960

ccgaatgaacgcacccatcaccatcatcatcattaa996

<210>4

<211>343

<212>prt

<213>cd63-pd-l1(cd63-pd-l1)

<400>4

alaglytyrvalpheargasplysvalmetserglupheasnasnasn

151015

pheargglnglnmetgluasntyrprolysasnasnhisthralaser

202530

ileleuaspargmetglnalaaspphelyscyscysglyalaalaasn

354045

tyrthrasptrpglulysileprosermetserlysasnargvalpro

505560

aspsercyscysileasnvalthrvalglycysglyileasnpheasn

65707580

glulysalailehislysgluglycysvalglulysileglyglytrp

859095

leuarglysasnvalglyglyglyglyserglyglyglyglysergly

100105110

glyglyglyserphethrvalthrvalprolysaspleutyrvalval

115120125

glutyrglyserasnmetthrileglucyslyspheprovalglulys

130135140

glnleuaspleualaalaleuilevaltyrtrpglumetgluasplys

145150155160

asnileileglnphevalhisglyglugluaspleulysvalglnhis

165170175

sersertyrargglnargalaargleuleulysaspglnleuserleu

180185190

glyasnalaalaleuglnilethraspvallysleuglnaspalagly

195200205

valtyrargcysmetilesertyrglyglyalaasptyrlysargile

210215220

thrvallysvalasnalaprotyrasnlysileasnglnargileleu

225230235240

valvalaspprovalthrsergluhisgluleuthrcysglnalaglu

245250255

glytyrprolysalagluvaliletrpthrserserasphisglnval

260265270

leuserglylysthrthrthrthrasnserlysarggluglulysleu

275280285

pheasnvalthrserthrleuargileasnthrthrthrasngluile

290295300

phetyrcysthrpheargargleuaspproglugluasnhisthrala

305310315320

gluleuvalileprogluleuproleualahisproproasngluarg

325330335

thrhishishishishishis

340

<210>5

<211>326

<212>prt

<213>cd9-pd-l1(cd9-pd-l1)

<400>5

serhislysaspgluvalilelysgluvalglngluphetyrlysasp

151015

thrtyrasnlysleulysthrlysaspgluproglnarggluthrleu

202530

lysalailehistyralaleuasncyscysglyleualaglyglyval

354045

gluglnpheileseraspilecysprolyslysaspvalleugluthr

505560

phethrvallyssercysproaspalailelysgluvalpheaspasn

65707580

lysphehisileglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly

859095

glyglyserphethrvalthrvalprolysaspleutyrvalvalglu

100105110

tyrglyserasnmetthrileglucyslyspheprovalglulysgln

115120125

leuaspleualaalaleuilevaltyrtrpglumetgluasplysasn

130135140

ileileglnphevalhisglyglugluaspleulysvalglnhisser

145150155160

sertyrargglnargalaargleuleulysaspglnleuserleugly

165170175

asnalaalaleuglnilethraspvallysleuglnaspalaglyval

180185190

tyrargcysmetilesertyrglyglyalaasptyrlysargilethr

195200205

vallysvalasnalaprotyrasnlysileasnglnargileleuval

210215220

valaspprovalthrsergluhisgluleuthrcysglnalaglugly

225230235240

tyrprolysalagluvaliletrpthrserserasphisglnvalleu

245250255

serglylysthrthrthrthrasnserlysarggluglulysleuphe

260265270

asnvalthrserthrleuargileasnthrthrthrasngluilephe

275280285

tyrcysthrpheargargleuaspproglugluasnhisthralaglu

290295300

leuvalileprogluleuproleualahisproproasngluargthr

305310315320

hishishishishishis

325

<210>6

<211>331

<212>prt

<213>cd81-pd-l1(cd81-pd-l1)

<400>6

phevalasnlysaspglnilealalysaspvallysglnphetyrasp

151015

glnalaleuglnglnalavalvalaspaspaspalaasnasnalalys

202530

alavalvallysthrphehisgluthrleuaspcyscysglyserser

354045

thrleuthralaleuthrthrservalleulysasnasnleucyspro

505560

serglyserasnileileserasnleuphelysgluaspcyshisgln

65707580

lysileaspaspleupheserglylysglyglyglyglyserglygly

859095

glyglyserglyglyglyglyserphethrvalthrvalprolysasp

100105110

leutyrvalvalglutyrglyserasnmetthrileglucyslysphe

115120125

provalglulysglnleuaspleualaalaleuilevaltyrtrpglu

130135140

metgluasplysasnileileglnphevalhisglyglugluaspleu

145150155160

lysvalglnhissersertyrargglnargalaargleuleulysasp

165170175

glnleuserleuglyasnalaalaleuglnilethraspvallysleu

180185190

glnaspalaglyvaltyrargcysmetilesertyrglyglyalaasp

195200205

tyrlysargilethrvallysvalasnalaprotyrasnlysileasn

210215220

glnargileleuvalvalaspprovalthrsergluhisgluleuthr

225230235240

cysglnalagluglytyrprolysalagluvaliletrpthrserser

245250255

asphisglnvalleuserglylysthrthrthrthrasnserlysarg

260265270

gluglulysleupheasnvalthrserthrleuargileasnthrthr

275280285

thrasngluilephetyrcysthrpheargargleuaspprogluglu

290295300

asnhisthralagluleuvalileprogluleuproleualahispro

305310315320

proasngluargthrhishishishishishis

325330