卵巢癌标志物CA125的定量检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种卵巢癌标志物ca125的定量检测试剂盒。

背景技术：

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，也是妇科肿瘤死亡率最高的肿瘤类型，死亡率约为25%，即每四个卵巢癌患者中就有一人死亡。据估计，中国每年每10万人中就有五人被诊断为新发卵巢癌。卵巢癌通常表现为附件肿块，因临床症状不明显，容易造成漏诊与误诊。因此，超过70-75%的卵巢癌患者确诊时已处于癌症晚期，并已扩散到其他器官，错过了最佳治疗时机。在女性的一生中，每五位女性就会有一位出现盆腔肿块，需要接受检查来排除恶性肿瘤的可能性。近20年来，卵巢癌的5年生存率一直徘徊在较低水平，5年内的复发率高达80%，且复发时间主要集中在治疗期的3年内。尽管卵巢癌的预后较差，但如果卵巢癌能被尽早诊断，癌细胞仅在于卵巢内，患者的存活率可以提高到75-95%，极有可能被治愈。因此，卵巢癌的早期诊断和治疗监测尤为重要。

目前，卵巢癌的诊断主要依据两种检测手段。一种是经阴道超声检查（tuv），这种成像方法可用于检查女性的生殖器官，包括子宫、卵巢、宫颈及阴道。尽管其应用较为普遍，但是这种方法并不能准确检测出该肿块是良性还是恶性。此外，该方法还需要经验丰富的临床技师对检测结果进行解读。

另一种常规检测方法是检测生物标志物ca125，这种方法被视为卵巢癌诊断的“金标准”。ca125是1981年由bast等从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体oc125结合的一种糖蛋白，来源于胚胎发育期体腔上皮，在正常卵巢组织中不存在，最常见于上皮性卵巢肿瘤（浆液性肿瘤）患者的血清中，其在检测卵巢上皮肿瘤患者血清中的阳性率高达82％-94％，在临床实践中研究发现患者血清中ca125的值与临床病理分期有关，随着临床分期的增高，ca125的含量也随之增高。可见卵巢癌的发生、发展和转归与ca125在患者血清中的表达有相关性。

酶免疫分析(enzymeimmunoassay)是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化相应的底物显色，达到定量分析的目的。该方法因操作简便、不需昂贵设备、不污染环境、加之酶标记物稳定性好、有效期长及应用范围广等优势，受到科研工作者广泛的青睐。酶联免疫吸附法(elisa)是应用最为广泛的一种酶免疫分析方法，该方法以酶（辣根过氧化物酶（hrp）或碱性磷酸酶（alp）)标记抗原或抗体，将免疫学反应的特异性与酶催化底物的高效性和专一性结合起来的一种分析方法。由于酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，使该方法具有较高的灵敏度。此外，elisa具有技术条件要求低、携带方便、操作简便和经济、有效期长、灵敏度高、特异性强、可实现大批量检测、常以试剂盒的形式出现且易商品化等优点，使之成为应用最为广泛和发展最为成熟的生物分析技术之一。酶联免疫吸附法在在ca125的测定上具有一定优势。

尽管酶免疫分析在分析检测领域获得了广泛的推崇，但该方法也存在一定的问题，如elisa易受外界因素干扰，造成假阳性；其次，elisa方法灵敏度偏低，无法实现对低浓度目标分析物的检测。因此，如何提高酶联免疫吸附法在ca125的测定上的灵敏度和准确性、减少检测周期是亟需解决的问题。

技术实现要素：

针对上述现有技术的缺陷，本发明意在提供一种ca125定量检测试剂盒，其不仅检测速度快，血液标本用量少，避免了非特异性结合，检测精密度高，稳定性好，为临床医师提供更准确的检测结果，极大改善卵巢癌的诊断与管理。本发明的技术方案如下：

一种卵巢癌标志物ca125的定量检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：

（1）已经包被了ca125的捕获抗体的酶标板；

（2）检测抗体体系，所述检测抗体体系通过以下方式制备得到：

a.在二氧化硅纳米微球表面负载cdse量子点，得到第一复合物，

b．对第一复合物进行硅烷化修饰，得到第二复合物，

c．对第二复合物进行环氧化修饰，得到第三复合物，

d．在第三复合物表面修饰上能够直接连接或间接连接所述捕获抗体且被辣根过氧化物酶标记的检测抗体。

进一步地，所述二氧化硅纳米微球的粒径小于100nm，所述cdse量子点的粒径小

于5nm。二氧化硅纳米微球的粒径与cdse量子点的粒径与检测灵敏度有关，当二

氧化硅纳米微球的粒径小于100nm，所述cdse量子点的粒径小于5nm时，检测灵敏度更高。

进一步地，所述试剂盒还包括：（3）ca125标准品；（4）洗涤液；（5）显色液；（6）酶反应终止液；（7）稀释液。

进一步地，其中所述第一复合物通过以下方式制备：在二氧化硅纳米微球中加入cdse量子点，超声直至溶液澄清，然后将溶液在10000～12000rpm转速下离心5～10min，使用甲苯洗去多余的cdse量子点，即可得到纯化的所述第一复合物。

进一步地，其中所述第二复合物通过以下方式制备：在超声条件下向所述第一复合物沉淀中加入正辛基三甲氧基硅烷，随后依次加入甲醇以及氨水，混合超声20～60min，最后用6000～10000rpm转速离心，用甲醇洗去多余的正辛基三甲氧基硅烷，即可得到纯化的所述第二复合物。

进一步地，其中所述第三复合物通过以下方式制备：将所述第二复合物加入到硅酸钠溶液中，搅拌反应12h以上，然后在溶液加入乙醇、氨水和原硅酸四乙酯，搅拌反应20～60以上，最后加入γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷，搅拌反应8～12h，用乙醇离心洗涤3次，即可得到纯化的所述第三复合物。

进一步地，其中检测抗体通过以下方式修饰到第三复合物上：将第三复合物分散至硼酸盐缓冲液中，加入被生物素标记的检测抗体，在室温下搅拌10～12h，所得到的产物用磷酸盐缓冲洗涤，即可得到所述检测抗体体系。

进一步地，其中所述捕获抗体为oc125单克隆抗体或m11单克隆抗体。

进一步地，其中：所述洗涤液（10x）为0.05%含有吐温-20的pbs缓冲液；所述显色液为tmb显色液；所述酶反应终止液为2m的浓硫酸。

自elisa发展和应用到实际检测中以来，科研工作者一直尝试着用不同的方式来解决elisa存在的问题。从传统的elisa到abs-elisa，然后到纳米elisa，elisa的应用范围不仅得到了拓展，而且检测性能也得到了极大的提升。然而，在对实际样品进行分析检测时，人们仍然希望看到具有高灵敏度、强稳定性、高准确度、简便操作和低成本等优异性能的检测方法，因此，在对elisa的改性上仍然有很多工作需要做。

本发明试剂盒从信号标签入手，通过采用特定修饰的纳米硅基材料来负载检测抗体，既实现了检测抗体体系的稳定性，也可以获得更高的灵敏度和准确度。跟传统的elisa相比，本发明的elisa试剂盒的信号响应强度可以增加5倍左右。而且，跟传统的ca125elisa检测试剂盒相比，检测时间缩短。

附图说明

图1是各个阶段二氧化硅纳米微球的电镜表征图。

图2是硅球负载hrp标记的检测抗体前后的状态图。

图3显示了不同检测抗体体系检测不同浓度ca125血清样本的颜色变化。

具体实施方式

以上所揭露的仅为发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

实施例1：第一复合物的制备

首先，取300μl商业化购买的巯基二氧化硅纳米微球（平均粒径约为90nm）离心沉淀，吹干后，加入3ml商业化购买的cdse（硒化镉）量子点（平均粒径约为3.5nm）超声15min，直至溶液变为澄清。然后，将溶液在10000rpm转速下离心6min，反复使用甲苯洗去多余的cdse量子点，这样即可得到纯化的第一复合物。

实施例2：第二复合物的制备

为了对第一复合物进行硅烷化修饰，在超声条件下向第一复合物沉淀中

加入125μl正辛基三甲氧基硅烷，随后依次加入9ml甲醇以及112μl氨水(25%)。混合超声30min后，8000rpm转速离心，用甲醇洗去多余的正辛基三甲氧基硅烷，即可得到纯化的第一复合物。

实施例3：第三复合物的制备

为了进一步的环氧化修饰，首先将上述硅烷化第二复合物加入到1μm硅酸钠溶液中搅拌反应12h以上,然后取10ml上述溶液加入40ml乙醇、1.2ml氨水和50μl原硅酸四乙酯搅拌反应20min，最后加入50μlγ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷搅拌反应10h，用乙醇离心洗涤2次，得到纯化后的第三复合物，置于4℃冰箱保存备用。

实施例4：检测抗体体系的制备

首先将环氧化第三复合物分散至硼酸钠缓冲液中（10mm,ph=9)，随后加入250μl辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg抗体（20μgml^-1)，在室温下搅拌反应12h。得到的产物用pbs溶液离心洗涤三次，即可获得所述检测抗体体系，置于4℃冰箱保存备用。该检测抗体体系可以用于ca125捕获抗体的检测。

为了认识硅基材料修饰过程中表面的变化，通过sem表征进行了进一

步的探究。如图1所示，没有修饰的二氧化硅纳米微球表面是一层光滑的二氧化硅壳层(图1a)，当负载完cdse量子点后，硅球表面均匀覆盖上了一层“草蓦状”的凸点(图1b)，该点状物为cdse量子点。当进一步硅烷化和环氧化修饰后，粗糙的硅球表面又变得稍微光滑(图1c)。最后修饰完检测抗体后，检测抗体体系的表面出现了能够识别的蛋白层(图1d)。该结果表明成功地合成了硅基化检测抗体体系。

为了探讨本发明检测抗体体系的性能，首先将该检测抗体体系与负载hrp（辣根过氧化氢酶）标记的检测抗体前的硅基材料（即第三复合物）和游离的hrp溶液进行对比。如图2a所示，本发明检测抗体体系与第三复合物在没有加入tmb显色液，溶液的颜色为淡黄色，hrp溶液的颜色为无色透明。当加入tmb显色液后，第三复合物的溶液颜色没有明显变化，依然保持为淡黄色，但是负载hrp标记的检测抗体的检测抗体体系和游离的hrp溶液都变为蓝色(图2b)。该结果说明负载hrp标记的检测抗体的检测抗体体系同游离的hrp溶液一样具有催化tmb显色的能力。

为了说明hrp标记的检测抗体是通过化学共价作用偶联到硅球上而不是非特异性吸附上的，将检测抗体体系溶液进行三次离心洗涤，如图2c所示，充分洗涤后的检测抗体体系溶液仍然具有良好的催化活性，且上清液没有明显的颜色变化。上述结果表明，本发明制备的检测抗体体系能保持良好的催化活性，并且hrp标记的检测抗体能够稳定地共价偶联到硅球表面，而不是非特异性吸附在硅球表面。此外，检测抗体体系的颜色变化以及离心后的上清液进一步表明hrp标记的检测抗体成功地修饰到硅球表面。

图2中，图2(a)是硅球负载hrp标记的检测抗体前后的状态图(1:第三复合物;2:检测抗体体系;3:游离的hrp)；(b)和(c)离心前后加入tmb显色液前后颜色变化图。

实施例5：elisa准备

1)制备洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20的pbs，ph=7.4):称取0.2gkh2p0和2.9gna2hp04·12h2o8.0gnacl和0.2gkcl，将称量的组分倒入烧杯中加水溶解，然后加入0.5mltween-20，将配制的溶液转移1l容量瓶中，加蒸馏水定容后待用。

2)制备包被缓冲液(00.05m碳酸盐缓冲液，ph=9.6):称取1.59gna2co3和2.93gnahc03，将称量的组分倒入烧杯中加水溶解，将配制的溶液转移

至1l的容量瓶中，然后加蒸馏水定容后待用。

3)制备封闭液:为了减少检测中出现的非特异性吸附，需要加入一定量的封闭液占据空白位点。制备封闭液是取0.1g牛血清白蛋白(bsa)，加洗涤缓冲液至100ml使用。

4)终止液配制(2mh2s04):量取蒸馏水178.3ml于试剂瓶中，缓慢加入21.7ml的浓硫酸(98%)，静置一段时间后超声混匀。

5)ca125标准品的制备：是分别含有25u/ml,50u/ml,100u/ml,200u/ml,800u/ml的ca125天然抗原的15mmol/lph7.4的pbs缓冲液。

6）捕获抗体：商业化购买的oc125单克隆抗体或m11单克隆抗体。

7）稀释液：含1.37%酪蛋白的ph7.4的磷酸盐缓冲液。

实施例6：间接elisa检测方法试验对ca125的检测能力

1)酶标板的包被

用上述制备好的包被缓冲液对ca125抗原进行稀释，然后将0.1ml该浓度的抗原溶液加样到孔板中，在4℃条件下过夜。将孔板中的溶液倒掉，然后在振荡条件下用上述洗涤液清洗3次。

2)酶标板的封闭

将包被过夜的孔板拍干，加入200μl/孔的上述封闭液，37⁰c封闭2h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，并于4℃备用。

3)待测抗体包被

取0.1ml的oc125单克隆抗体滴加到孔板中，空白孔和阴性血清作为对照组，放置于37℃恒温箱中孵育1小时，然后按照洗涤3次。

4)检测抗体识别

在上述包被的孔板中，分别加入0.1ml实施例4制备的检测抗体体系，然后在37℃下孵育0.5～1小时，用洗涤液洗涤3次，拍干。

5)溶液显色:在上述拍干的孔板中，加入50μltmb显色液，在37℃条件下避光显色10～30分钟。

6）终止反应：待显色完全后，加入2m的浓硫酸终止显色。

7)结果判定:将孔板放置在白纸上，直接用肉眼观察结果。若孔板内溶液黄色越深，则表明ca125浓度越大，空白或阴性对照组为无色。

为了更好的评价本发明试剂盒在实际样品分析中的性能，将ca125阳性血清进行不同比例的稀释，然后将一系列稀释后的阳性血清样本按照标准elisa方法操作，最后加入本发明的检测抗体体系和常规的检测抗体进行检测，结果发现本发明的检测抗体体系对不同的实际血清样本具有很好的响应。

图3中a为传统的elisa试剂盒;b为本发明的elisa试剂盒。分别设置了1:10²，5:10³，1:10³，5:10⁴，1:10⁴，5:10⁵，1:10⁶等六个浓度梯度的稀释比。显色结果表明，通过肉眼可以直接观察到不同浓度的ca125阳性待测样品，跟传统的elisa相比，本发明的elisa试剂盒的信号响应强度可以增加5倍左右。

实施例7：检测ca125试剂盒

按照上述方法将ca125的捕获抗体（oc125单克隆抗体）包被到酶标板上，并用封闭液进行了封闭。其他试剂的制备如上。

1)加入梯度稀释的ca125蛋白标准品与待检测的血清样品，每个样品做两个重复，每孔加100ul，37⁰c反应40分钟；

2)配置1x洗涤液于洗板机上洗板5次共10分钟；

3)将稀释液加入检测抗体混匀，加入微孔板中孵育40分钟；

4)再次洗涤并加入底物反应10分钟，加入终止液显色，于酶标板上读数；

根据读数计算标准曲线，可以得出读数与ca125蛋白标准品之间的线性关系，将样品的od值代入线性公式得出样品的含量，整个过程不超过1.5个小时。试剂盒的各个指标的检测结果如下。

表1：最低检测限试验结果

为了检测该试剂盒的特异性，选取了he4（人附睾蛋白4）、ca153(糖类抗原153)、afp（甲胎蛋白）、cea（癌胚抗原）作为参考蛋白。结果如下:

表2：he4，ca153，afp,cea对ca125测值结果的影响（u/ml）

表3：试剂盒的交叉反应

根据上述结果，我们确定ca125试剂盒的分析特异性指标如下。

表4：试剂盒的特异性指标

对ca125试剂盒进行了准确性测试，结果如下。

表5：准确性结果

对不同批次的ca125试剂盒进行了准确性测试，结果如下。

表6：重复性结果

表7：三批试剂盒检测同一份质控品的结果

同时，检测了试剂盒的剂量反应曲线，结果如下。

表8：试剂盒检测od值与相关系

表9：hook效应剂量研究结果

表10：ca125试剂盒hama效应检测结果

表11：ca125试剂盒rf效应检测结果

表12：ca125试剂盒抗肿瘤药物干扰试验结果

表13：加速试验结果

表14：长期稳定性研究结果

表15：本发明ca125试剂盒和商业化购买的对比试验结果