一种定量检测人几丁质酶3样蛋白1的化学发光试剂盒的制作方法

本发明涉及免疫分析
技术领域：
，具体地说，是一种定量检测人几丁质酶3样蛋1(ykl-40/chi3l1)的化学发光试剂盒。
背景技术：
：几丁质酶3样蛋白1(chitinase-3-like-1protein，简称chi3l1)，又称为软骨糖蛋白39(ykl-40)，是糖基水解酶18家族成员，但其缺乏水解活性，chi3l1蛋白参与细胞增值和血管生成。目前学术界对其研究发现几丁质酶3样蛋白1与哮喘和过敏性疾病以及多种肿瘤发生有关。目前几丁质酶3样蛋白1的检测主要应用于科学研究，对于临床的研究还处于初发阶段。针对几丁质酶3样蛋白1的检测，目前主要有酶联免疫法(elisa)、免疫组织化学法(ihc)等，酶联免疫法检测几丁质酶3样蛋白1为血清学检测，受其方法学限制，检测灵敏度较低，检测线性范围较窄；免疫组织化学法的检测样本来源于人体组织/细胞，样本获取困难，检测成本高，检测技术门槛较高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、特异性好、操作简便，检测通量高，检测成本低，且不需要太多复杂的辅助设备和试剂的定量检测人几丁质酶3样蛋1(ykl-40/chi3l1)的化学发光试剂盒。为了实现上述目的，本发明提供一种定量检测人几丁质酶3样蛋白1(ykl-40/chi3l1)的化学发光试剂盒，包括：包被有人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的化学发光板，生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体，链霉亲和素标记的酶底物，以及酶促发光底物。进一步的，包被于化学发光板中的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的浓度为2～8ug/ml。其中的包被封闭液为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。进一步的，所述的化学发光板采用保护蛋白进行封闭处理，所述的保护蛋白为酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、动物血清或人血清等。进一步的，所述的生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的缓冲液为磷酸盐缓冲液或tris盐缓冲液。进一步的，所述的链霉亲和素标记的酶底物中的酶为辣根过氧化氢酶、碱性磷酸酶等。更进一步的，所述的链霉亲和素标记的酶底物的缓冲液为磷酸盐缓冲液或tris盐缓冲液。进一步的，所述的生物素标记抗体的缓冲液和链霉亲和素的缓冲液中，可加入适量的表面活性剂(包括但不限于吐温20等)，用于增加去除检测背景值，提高信噪比。进一步的，所述的酶促发光底物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的酶促发光底物等。在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒中还包含人ykl-40校准品。本发明的第二方面，提供一种如上所述的定量检测人ykl-40的化学发光试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(a)制备包被有人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的化学发光板；(b)生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体工作液的制备：制备生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体，稀释液稀释，稀释比例为1:500～1:5000(优选为1:1000)；(c)链霉亲和素标记的辣根过氧化物没或碱性磷酸酶工作液的制备：用稀释液稀释链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，稀释比例为1:200～1:2000(优选1:1000)；(d)人ykl-40校准品制备：稀释浓度梯度为：62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml，用于制作检测标准曲线；(e)洗涤液的配置：0.01mpbst溶液，配制1l的洗涤液：二水磷酸二氢钠9.75g、十二水磷酸氢二钠51g、氯化钠155g、tween2010ml，内含0.1％proclin300，使用时利用超纯水20倍稀释。更进一步的，所述的步骤a包被有人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的化学发光板的制备方法，包括以下步骤：利用磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液将人ykl-40单克隆抗体或多克隆抗体稀释至2～8ug/ml，按照100ul/孔加入化学发光板中，并于4℃放置16～20小时后，取出化学发光板，甩干残液，利用牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、动物或人血清等进行封闭处理，按照120ul～300ul/孔加样，37℃放置2小时或4℃放置16～20小时，甩干残液，干燥保存于4℃备用。更进一步的，所述的步骤b中稀释液为：0.01mpb缓冲液(ph7.4)，1％酪蛋白或1％bsa，0.1％proclin300。更进一步的，所述的步骤b生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：利用0.1mpbsph7.2配制10mmnhs-dpeg4-biotin工作溶液；按照1份质量摩尔数的人ykl-40单克隆抗体或多克隆抗体和10份质量摩尔数的nhs-dpeg4-biotin将人ykl-40单克隆抗体或多克隆抗体加入适量的10mmnhs-dpeg4-biotin工作溶液中，于室温反应1小时或37℃反应10～15min，利用葡聚糖凝胶分离纯化，去除游离生物素；加入0.1％bsa，放置4℃备用。购买生物素标记试剂盒操作也可。更进一步的，所述的步骤c中稀释液为：0.1mtris盐缓冲液(ph7.4)，1％酪蛋白或1％bsa，0.1％proclin300。更进一步的，所述的步骤d中人ykl-40校准品抗原为基因重组的浓度≥95％的人ykl-40蛋白或国际(who/nibsc)和国家中检院提供的或商业化第三方重组人ykl-40抗原物质；本发明试剂盒中涉及的人ykl-40校准品的稀释液为无血清培养基(aim-v)或含1％bsa的pb缓冲液，内含0.1％proclin300。本发明的第三方面，提供一种使用如上所述的化学发光试剂盒定量检测人ykl-40的方法，包括以下步骤：a)20倍稀释浓缩洗涤液至工作浓度；b)按照稀释梯度进行标准品浓度稀释，并加入化学发光板中，50ul/孔，做好标示；c)按照50ul/孔加入血清/血浆/细胞裂解液等至对应板孔，做好标示；d)取生物素标记的人ykl-40抗体工作液，按照50ul/孔加入对应板孔；e)37℃孵育2h，取出，每孔250ul洗涤液，洗涤4次，拍干；f)取链霉亲和素标记的过氧化物酶工作液或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶工作液，按照50ul/孔加入对应反应孔；50ul/孔，放置37℃反应30min；g)取出发光板，每孔250ul洗涤液，洗涤4次，拍干；h)每孔加入50ul酶促发光底物，读取发光值；i)制作标准曲线，计算出待测样本的浓度值。进一步的，所述的步骤i为：分别以校准品梯度的浓度值作为x值，对应的发光rlu值作为y值，制作一元一次方程式，获得曲线方程；将待测样本的发光值(y)代入一元一次方程式，计算出对应待测样本浓度值。本发明采用酶促化学发光法，将人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体包被于化学发光板中，利用酶促催化发光底物，并利用生物素放大系统，提高了试剂盒的灵敏度和准确性；同时对于样本使用量为50～100ul；实验证明，化学发光法配合生物素放大系统是一种检测人ykl-40的有效方法，且进一步证明了对25～100ul的血样量的检测结果也有效的符合于临床评判。本发明的有益效果体现在：1、化学发光法配合生物素放大系统检测系统，本发明试剂盒的检测灵敏度明显高于市场上常规elisa检测人ykl-40试剂盒，能够对elisa检测低浓度的样本，做出很好的结果判断；2、本发明试剂盒在血样要求上，可直接使用分离后的外周血血清和血浆，且两者无明显差异，可实现大通量检测，可实现半自动化或全自动化批量操作。3、目前市场上的elisa试剂盒所需样本量为100ul及以上，本发明试剂盒对于血样样本量的最高要求仅为50ul，大大减少了病人的血样量需求。本发明采用酶促化学发光法，利用化学发光板中的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体作为捕获抗体，以生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体作为检测抗体，用酶促发光底物为催化酶催化发光底物发光，并配合生物素放大系统进行检测。提高了试剂盒的检测灵敏度和准确性，且便于大通量样本检测，是一种有效便捷且能够大通量检测人ykl-40的方法。附图说明图1：人ykl-40化学发光检测试剂盒的标准曲线。具体实施方式下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。本发明所述的定量检测人几丁质酶3样蛋白1(ykl-40/chi3l1)的试剂盒：包括包被有适量浓度人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的化学发光板，生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体，链霉亲和素标记的酶底物(包括但不限于辣根过氧化氢酶、碱性磷酸酶等)以及酶促发光底物和人ykl-40校准品。实施例1：本发明试剂盒的制备1.人ykl-40单克隆抗体或多克隆抗体包被化学发光板的制备利用磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液将人ykl-40单克隆抗体或多克隆抗体稀释至2～8ug/ml，按照100ul/孔加入化学发光板中，并于4℃放置16～20小时后，取出化学发光板，甩干残液，利用如牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、动物或人血清等进行封闭处理，按照120ul～300ul/孔加样，37℃放置2小时或4℃放置16～20小时，甩干残液，干燥保存于4℃备用。2.生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体的制备利用0.1mpbsph7.2配制10mmnhs-dpeg4-biotin工作溶液。按照一定比例将人ykl-40单克隆抗体或多克隆抗体加入适量的10mmnhs-dpeg4-biotin工作溶液中，于室温反应1小时或37℃反应10～15min，利用葡聚糖凝胶分离纯化，去除游离生物素。加入0.1％bsa，放置4℃备用。3.生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体工作液的制备1)稀释液的制备：0.01m磷酸缓冲液(pb，phosphatebuffer)(ph7.4)，1％酪蛋白或1％bsa，0.1％proclin300；2)工作液的制备：用稀释液稀释生物素标记好的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体后得到生物素标记的人ykl-40单克隆抗体或人ykl-40多克隆抗体工作液，其稀释比例为1:1000。4.链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的制备采用戊二醇法，将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶配置成50iu/ml，取适量，加入含1.25％戊二醛的ph6.8的pbs溶液中，混匀至室温下反应过夜。收集反应液，利用pbs(ph7.2)透析4次，取适量链霉亲和素sa溶于1mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.5)中，与透析后的反应液混匀，于4℃反应，并加入适量0.2mol/l赖氨酸溶液。混匀，室温反应2小时，利用0.05mol/lpbs(ph7.2)透析4次。离心取上清液，至4℃备用。购买商用链霉亲和素标记试剂盒操作也可。5.链霉亲和素标记的辣根过氧化物没或碱性磷酸酶工作液的制备1)稀释液的制备：0.1mtris盐酸缓冲液(ph7.4)，1％酪蛋白或1％bsa，0.1％proclin3002)工作液的制备：用稀释液稀释链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶后得到链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶工作液或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶工作液，其稀释比例为1:1000。6.校准品的制备人ykl-40校准品抗原为基因重组的浓度≥95％的人ykl-40蛋白或国际(who/nibsc)和国家中检院提供的或商业化第三方重组人ykl-40抗原物质，本发明试剂盒中涉及的人ykl-40校准品的稀释液为无血清培养基(aim-v)或含1％bsa的pb缓冲液，内含0.1％proclin300。稀释浓度梯度为：62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml、2000pg/ml、4000pg/ml，用于制作检测标准曲线。7.洗涤液的制备本发明试剂盒所述的洗涤液为0.01mpbst溶液，配制1l的洗涤液：二水磷酸二氢钠9.75g、十二水磷酸氢二钠51g、氯化钠155g、tween2010ml，内含0.1％proclin300，使用时利用超纯水20倍稀释。实施例2：使用本发明试剂盒检测人ykl-40的方法使用本发明试剂盒检测人ykl-40的方法，包括以下步骤：a)20倍稀释浓缩洗涤液至工作浓度；b)按照稀释梯度进行标准品浓度稀释，并加入化学发光板中，50ul/孔，做好标示；c)按照50ul/孔加入血清/血浆/细胞裂解液等至对应板孔，做好标示；d)取生物素标记的人ykl-40抗体工作液，按照50ul/孔加入对应板孔；e)37℃孵育2h，取出，每孔250ul洗涤液，洗涤4次，拍干；f)取链霉亲和素标记的过氧化物酶工作液或链霉亲和素标记的碱性磷酸酶工作液，按照50ul/孔加入对应反应孔；50ul/孔，放置37℃反应30min；g)取出发光板，每孔250ul洗涤液，洗涤4次，拍干；h)每孔加入50ul酶促发光底物，读取发光值；i)分别以校准品梯度的浓度值作为x值，对应的发光rlu值作为y值，制作一元一次方程式，获得曲线方程；将待测样本的发光值(y)代入一元一次方程式，计算出对应待测样本浓度值。实施例3：本发明试剂盒的方法学评价a)标准曲线本发明试剂盒用校准品浓度值(0pg/ml剔除，该值作为反应板本底考虑，不计入标准曲线范围内)作为x值，对应浓度检测的发光值rlu做y值，以此做一元一次方程。如图1所示，所绘制的标准曲线回归方程为y＝108.3x-15630，r2＝0.99634。b)最低检出限本发明试剂盒在检测标准曲线的同时检测最低检出限参考品(62.5pg/ml)10次，并通过标准曲线计算最低检出限参考品的平均浓度值(x)和标准差(sd)。根据公式：检出限＝x±2sd，计算样品的最低检出限，结果如表1，本发明试剂盒对血样检测人ykl-40的最低检出限为49.34pg/ml＜62.5pg/ml。表1humanykl-40化学发光检测试剂盒的最低检出限样本平均值(pg/ml)标准差(pg/ml)最低检出限(pg/ml)正常人血样66.868.7649.34c)精密性同上述2.2的检测结果，本发明试剂盒利用标准差(sd)/平均浓度值(x)所获得的比值即为精密性值，即：标准差8.76pg/ml除以平均浓度值66.86pg/ml，乘以100％，为13.10％＜15％。d)阴阳性符合率筛选20例新鲜血样，10例明确正常人群样本，10例明确哮喘病人样本。利用本发明试剂盒进行免疫反应检测。对血样进行编号：10例阴性样本n1～n10；10例阳性样本p1～p10标准曲线浓度值作为x轴。发光值作为y轴，做一元一次方程，拟合标准曲线，同时将样本检测发光值带入方程式中y值，计算出x值，即为对应样本发光值的浓度值。对该些浓度值进行数据分析。本发明试剂盒检测的结果如表2所示：表2人ykl-40化学发光试剂盒检测10例正常人血样、10例哮喘病人血样的结果采用本发明试剂盒检测人ykl-40与目前市面上所拥有的elisa方法学检测试剂盒相比较，具有操作简便、操作灵敏度高、特异性好、检测范围宽、样本使用量少等的优点。以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。当前第1页12