快速检测复杂基质中蛋白质的分析方法

1.本发明涉及生物质谱分析领域，特别涉及复杂基质中蛋白质的快速检测方法。


背景技术：

2.蛋白质需要在复杂的环境下实现其生物功能，细胞内的环境包括离子强度、大分子拥挤等，对蛋白质的功能有重要影响。在生理条件下观察蛋白质和蛋白质相互作用将提供更接近实际状态的结果。
3.为了实现蛋白质的检测，往往需要借助固相微萃取、凝胶电泳、离子色谱、酶解法等方式，将蛋白质从复杂的基质中分离出来，需要消耗长达数十分钟的前处理时间，且往往需要消耗微摩尔级别的蛋白质，需要大量的蛋白质样品的消耗，无法实现亚飞摩尔级微量蛋白的检测。
4.同时，传统的方法，为了实现蛋白质及其配体的检测，往往需要采用高浓度乙酸铵进行电离的天然质谱法，保留在高离子强度条件下检测蛋白质及其复合物的能力。然而，当蛋白质存在于复杂基质中，复杂基质内存在大量的无机盐及代谢物的干扰时，天然质谱受到严重的基质抑制，难以实现蛋白及其配体的分析。
5.本发明提出了一种在细胞裂解液中检测蛋白质和蛋白质复合物的有效策略。通过毛细管的内表面用于快速吸附复杂基质中的蛋白质。内表面吸附的蛋白质被解吸，并实现快速质谱检测。采用本方法，蛋白质及其配体的特异性相互作用可以在细胞裂解液中保留并被质谱检测。


技术实现要素：

6.本发明解决的是无机盐和小分子物质存在下蛋白质的检测。现有技术直接进行含无机盐和小分子物质的蛋白质的溶液的检测，会受到无机盐和小分子物质的信号干扰，导致蛋白质无法在质谱里获得响应，无法实现蛋白质的检测。采用本发明的方法，即可快速检测蛋白质，优势是
①
检测所需蛋白质含量少，
②
复杂基质下能检测到蛋白质，
③
快速检测，
④
不仅能检测蛋白质，还能检测蛋白质相互作用。
7.具体来说，本发明提供以下技术方案：
8.一方面，本发明提供快速检测复杂基质中蛋白质的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.步骤(1)：将毛细管插入包含蛋白质的溶液中，吸入溶液；
10.步骤(2)将吸入溶液的毛细管，静置，使蛋白质充分吸附于毛细管内表面；
11.步骤(3)将毛细管内的残余溶液推出；
12.步骤(4)向毛细管内注入解吸附溶液；
13.步骤(5)将毛细管放置于离子化装置上，进行蛋白质的离子化；
14.步骤(6)使用质谱仪进行蛋白质的离子化信息检测，获得蛋白质的信号。
15.在一些实施方案中，步骤(2)的静置时间为5-100s。
16.在一些实施方案中，在步骤(3)和步骤(4)之间还包括洗涤步骤。
17.在一些实施方案中，所述洗涤步骤通过去离子水进行。
18.在一些实施方案中，所述洗涤次数为1-50次，优选5次。
19.在一些实施方案中，质谱仪可以为磁质谱仪、四级杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪或者傅里叶变换回旋共振质谱仪。仪器分辨率越高，获得蛋白质同位素谱图越精细。
20.在一些实施方案中，包含蛋白质的溶液选自包含在水溶性溶剂或脂溶性溶剂或复杂基质中的蛋白质，优选地，所述水溶性溶剂选自水溶液及低浓度无机盐溶液(无机盐离子浓度少于150mm)，所述脂溶性溶剂选自但不限于甲醇、乙腈、氯仿和二甲基亚砜，所述复杂基质选自但不限于无机盐离子浓度超过150mm的溶液，例如生理盐水、磷酸缓冲溶液、细胞培养基、tris-hcl溶液、hepes溶液、mes溶液、血清、尿液、唾液和细胞裂解液。
21.在本发明中，对细胞培养基的种类没有限制，因为所有培养基都包含大量的无机盐和小分子物质。
22.在本发明中复杂基质是指溶剂中存在的无机盐、小分子物质。蛋白存在于水溶性和脂溶性溶剂中，通常会加入无机盐，如氯化钠等，加入小分子物质，如hpes/tris/mes/氨基酸等小分子物质，用于维持蛋白的结构和功能，而这些无机盐和小分子会影响蛋白质的质谱检测。
23.在一些实施方案中，所述毛细管的针尖开口直径为1纳米到10毫米，优选1微米-20微米。
24.在一些实施方案中，所述毛细管吸入的蛋白质溶液的体积，范围为0.01飞升到1000升。
25.在一些实施方案中，所述毛细管吸入溶液后，内表面吸附蛋白质时间范围为1飞秒到1000小时，优选地，30秒可以获得稳定的蛋白质信号。
26.在本发明中，大部分蛋白质可以快速吸附，但有少量种类的蛋白质，受其吸附特性限制，其需要较长时间才能吸附完全。
27.在一些实施方案中，吸入溶液的方式，可以是毛细管的自吸或在毛细管内施加负0.01-10000kpa的负气压，推出溶液的方式，可以是在毛细管内施加正0.01-10000kpa的正气压。
28.在本发明中，受毛细管微通道的流动性影响，毛细管开口小于1微米时，优选地使用10000kpa的压力，毛细管的开口大于1微米且小于100微米时，优选地采用100kpa的压力；开口大于100微米时，优选地选用0.01kpa的压力。
29.在一些实施方案中，所述解吸附溶液选自去离子水、蒸馏水、醋酸铵、甲酸铵、碳酸氢铵、氯化铵、甲酸、乙酸和其混合物，用于进行蛋白质的解吸附。
30.在一些实施方案中，所述解吸附溶液选自去离子水、蒸馏水、1-1000mm醋酸铵、1-1000mm甲酸铵、1-1000mm碳酸氢铵、1-1000mm氯化铵、0.01-10％甲酸、0.01-10％乙酸和其混合物，用于进行蛋白质的解吸附。
31.去离子水为在蒸馏水的基础上，进一步除去里面的微量盐和微量无机物。
32.在一些实施方案中，所述解吸附溶液为甲酸，用于蛋白质单体的检测。
33.在一些实施方案中，所述解吸附溶液为0.01-10％的甲酸，用于蛋白质单体的检
测。
34.在一些实施方案中，所述解吸附溶液为醋酸铵，用于蛋白质复合物的检测。
35.在一些实施方案中，所述解吸附溶液为1-1000mm醋酸铵，用于蛋白质复合物的检测。
36.在一些实施方案中，所述毛细管材质可以为但不限于石英、硼硅酸盐玻璃、塑料和金属。
37.在一些实施方案中，所述毛细管材质选自石英、硼硅酸盐玻璃、塑料和金属。
38.在一些实施方案中，所述毛细管灌入解吸附溶液后，解吸附时间范围为1飞秒到1000小时，优选地，10秒可以获得稳定的蛋白质信号。
39.大部分蛋白质可以快速解吸附，但有少量种类的蛋白质，受其解吸附特性限制，其需要较长时间才能解吸附完全。
40.在一些实施方案中，将毛细管放置在距离质谱入口2-10毫米的位置进行离子化。
41.在一些实施方案中，蛋白质在溶液中的存在形式包括但不限于蛋白质单体、蛋白质-金属复合物、蛋白质-蛋白质复合物、蛋白质-核酸复合物、蛋白质-小分子复合物。
42.在一些实施方案中，蛋白质在溶液中的存在形式选自蛋白质单体、蛋白质-金属复合物、蛋白质-蛋白质复合物、蛋白质-核酸复合物、蛋白质-小分子复合物。
43.定义
44.复杂基质：包含超过0.01mm的无机盐离子或0.01mm的小分子物质，或者同时包含超过0.01mm的无机盐离子和0.01mm的小分子物质的溶液，，常见的有生理盐水、dmem培养基、hepes缓冲溶液、mes缓冲溶液、磷酸缓冲溶液和tris-hcl缓冲溶液。
45.minisog：mini-sog单线态氧产生者(mini singlet oxygen generator,)是改造于拟南芥向光素2蛋白而获得的小分子荧光黄素蛋白，是分析化学和生物学常用的细胞内示踪蛋白。
46.sfgfp：超折叠绿色荧光蛋白(superfolder green fluorescent protein，简称sfgfp)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光，是分析化学和生物学常用的细胞内示踪蛋白。
47.killerred：是第一个完全由基因编码的光毒性红色荧光蛋白，可接受绿色光照(540～580nm)生成活性氧(ros)，对dna、蛋白质、脂肪等造成损伤或者激发细胞内信号瀑布，影响细胞的代谢或增殖，甚至诱导细胞死亡，通常用于分析化学或生物学中作为模型蛋白)
48.有益效果
49.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
50.1.本发明可以实现复杂基质和细胞裂解液中亚飞摩尔级(蛋白质的含量)的高灵敏度的蛋白质检测，任意一种质谱仪均可实现此方法的蛋白质检测，无需限定。
51.2.本发明快速吸附、解吸附、离子化和质谱检测一体化，在一分钟内实现复杂基质的中蛋白质的快速检测。
52.3.本发明可以实现复杂基质中蛋白质和配体的相互作用的检测。
附图说明
53.图1示出了本发明的快速蛋白质检测流程示意图，包含蛋白质的吸附、蛋白质的纯化(溶剂的去除)、蛋白质的解吸附、蛋白质离子化和蛋白质的检测等步骤。
54.图2示出了毛细管7次平行取样的明场图。
55.图3示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，用时长为5、10、30和50秒进行蛋白质吸附的效果图。
56.图4示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，吸附时间与信号强度的优化曲线图。
57.图5示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，用时长为1、10、30和300秒进行蛋白质解吸附的效果图。
58.图6示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，解吸附时间与信号强度的优化曲线图。
59.图7示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，用针尖直径为40、10、2和1微米的毛细管进行蛋白质检测的效果图。
60.图8示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，毛细管针尖直径大小与信号强度的优化曲线图。
61.图9示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，用去离子水洗涤0、5、20和50次的毛细管进行蛋白质检测的效果图。
62.图10示出了1μm
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细胞色素c溶解于磷酸缓冲溶液中后，毛细管洗涤次数与信号强度的优化曲线图。
63.图11示出了用1％的甲酸、盐酸、乙酸和500mm乙酸铵进行蛋白质解吸附的效果图。
64.图12示出了用1％的甲酸、去离子水、100mm、250mm和500mm醋酸铵进行蛋白质解吸附的效果图。
65.图13示出了1μm
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细胞色素c溶解于dmem、hepes、mes和tris-hcl溶液中后，毛细管针尖吸附后，用1％甲酸进行蛋白质检测的效果图。
66.图14示出了1μm
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细胞色素c溶解于dmem、hepes、mes和tris-hcl溶液中后，毛细管针尖吸附后，用1％甲酸进行蛋白质检测的效果图。
67.图15示出了1μm
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细胞色素c溶解于dmem、hepes、mes和tris-hcl溶液中后，直接用常规电喷雾法进行蛋白质检测的效果图。
68.图16示出了1μm
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的钙调蛋白溶解于含有4、2和0微摩尔钙离子的磷酸缓冲溶液中，毛细管吸附后，用500mm醋酸铵作为溶剂进行蛋白质检测的质谱图。
69.图17示出了1μm
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的钙调蛋白溶解于含有4、2和0微摩尔钙离子的磷酸缓冲溶液中，直接用常规电喷雾法进行蛋白质检测的质谱图。
70.图18示出了高表达killerred蛋白的大肠杆菌裂解液用毛细管吸附后，用1％甲酸进行蛋白质检测的效果图。
71.图19示出了高表达mini-sog蛋白的大肠杆菌裂解液用毛细管吸附后，用1％甲酸进行蛋白质检测的效果图。
72.图20示出了高表达sfgfp蛋白的大肠杆菌裂解液用毛细管吸附后，用1％甲酸进行蛋白质检测的效果图。
73.图21示出了高表达hif-1α和taz1蛋白的大肠杆菌裂解液用毛细管吸附后，用500mm醋酸铵进行蛋白质检测的效果图。
74.图22示出了高表达hif-1α和taz1蛋白的大肠杆菌裂解液用毛细管吸附后，用1％甲酸进行蛋白质检测的效果图。
具体实施方式
75.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
76.实施例1.复杂基质中蛋白质的快速检测
77.本发明复杂基质中蛋白质的快速检测方法整体流程如图1所示，主要包括以下步骤：
78.步骤1，将开口直径为5微米的毛细管插入待测溶液中，溶液为细胞色素c(cytc)的磷酸缓冲溶液，吸入15纳升的溶液(图2)；
79.步骤2，将包含吸入的细胞色素c(cytc)的磷酸缓冲溶液的毛细管，静置30秒，使蛋白质充分吸附于毛细管内表面；
80.步骤3，将毛细管内的残余磷酸缓冲溶液推出；静置30秒后，推出毛细管内的残留溶液，吸入去离子水进行洗涤，然后推出去离子水；
81.步骤4，向毛细管内注入100微升的1％的甲酸溶液，并静置10秒钟，使蛋白质充分地从毛细管内表面解吸附下来；
82.步骤5，将毛细管放置于离子化装置上，采用感应式电极进行单细胞离子化，输出波形调节为正弦波，电压频率调节为1000hz，电压vpp为3kv，针尖距离质谱入口2毫米；采用感应式电极，防止毛细管内溶液被污染。
83.步骤6，轨道阱质谱为exactive plus质谱仪(thermofisher scientific，ca，usa)，其采集参数为：质量扫描范围60-900，质量分辨率140000，agc阈值1e6，正离子模式，s-lens射频电平50％，毛细管传输温度275℃，平均谱帧数1帧，采集时间5min；
84.步骤7，调节步骤2中毛细管的吸附时间为5，10，30和50秒钟，获得蛋白质的质谱图如图3所示，优化曲线如图4所示，5秒钟的吸附时间即可检测到蛋白质的信号，延长时间可以获得更高的蛋白质信号。
85.调节步骤4中蛋白质的解吸附时间为1，10，30和300秒，获得蛋白质的质谱图如图5所示，优化曲线如图6所示，可以看到本方法仅需1秒钟即可实现蛋白质的解吸附，且解吸附时间越长，蛋白质信号越好，能够检测到1fmol的蛋白质。
86.调节步骤1中毛细管的开口直径为1、2、10和40μm，获得蛋白质的质谱图如图7所示，优化曲线如图8所示，可以看到，随着毛细管开口直径的缩小，可以获得更好的蛋白质信号，在开口直径为2微米时，蛋白质的信号最好，能够检测到1fmol的蛋白质。
87.调节步骤3中毛细管吸附蛋白质后的洗涤次数，洗涤次数为1，5，20和50次，获得蛋白质的质谱图如图9所示，优化曲线如图10所示，可以看到，随着毛细管洗涤次数的增加，蛋白质信号呈现先增加后降低的趋势，在洗涤次数达到5次时，蛋白质的信号最好，能够检测到1fmol的蛋白质。
88.调节步骤4中的解吸附溶液为甲酸、盐酸、乙酸、和醋酸铵溶液，获得蛋白质的质谱
图如图11所示，可以看到利用甲酸作为解吸附溶液，蛋白质成高电荷态分布，高电荷态的蛋白属于解折叠型蛋白，无法保留蛋白相互作用和蛋白质复合物，但可以用于蛋白质单体的高灵敏度检测。而盐酸则会导致蛋白质谱峰展宽，导致蛋白质的分子量无法准确识别，乙酸可以实现蛋白质的解吸附，醋酸铵可以使蛋白质获得更低的电荷态分布，使蛋白的结构更加折叠和稳定，可以实现蛋白质及其复合物的检测。由此证实，本方法用甲酸作为解吸附溶剂可以实现蛋白质单体的高灵敏检测，用醋酸铵作为解吸附溶剂可以实现蛋白质复合物的检测。
89.调节步骤4中的解吸附溶液为100，250和500mm的醋酸铵溶液，获得蛋白质的质谱图如图12所示，蛋白质可以被解吸附下来，且电荷态分布随着醋酸铵的浓度增高而降低，说明本方法利用500mm的醋酸铵溶液作为解吸附溶液，可以获得更好的蛋白质折叠态的信号。可以实现复杂基质中蛋白质的电荷态的调控。
90.调节步骤1中的待测溶液的成分，让细胞色素c蛋白溶解于dmem培养基、hepes缓冲溶液、mes缓冲溶液和tris-hcl缓冲溶液中，其中磷酸缓冲溶液、dmem培养基、hepes缓冲溶液、mes缓冲溶液和tris-hcl缓冲溶液内包含浓度超过150mm的无机盐离子，为分析化学检测中常见的复杂基质。
91.使用甲酸溶液作为解吸附溶剂，获得蛋白质的质谱图如图13所示，可以获得高电荷态的细胞色素c的信号；使用醋酸铵溶液作为解吸附溶剂，获得蛋白质的质谱图如图14所示，可以获得低电荷态的细胞色素c的信号。说明本方法可以对多种复杂基质中的蛋白质进行有效的检测(复杂基质溶液中无机盐浓度超过150mm)，而作为对比，常规的电喷雾，将蛋白质溶液直接装载入毛细管中，并施加电压使溶液离子化，由于无法去除复杂基质中的干扰，获得蛋白质的质谱图如图15所示，无法获得蛋白质的信号(将蛋白质溶液直接装载入毛细管中，并施加电压使溶液离子化)。
92.实施例2.复杂基质中蛋白质-离子相互作用的快速检测
93.步骤1，将钙调蛋白cam溶解于磷酸缓冲溶液中，并分别加入0、2和4微摩尔的氯化钙离子，形成待测溶液；
94.步骤2，将开口直径为5微米的毛细管插入待测样品中，吸入15纳升的溶液；
95.步骤3，将吸入待测样品的毛细管，静置30秒，使蛋白质充分吸附于毛细管内表面；
96.步骤4，将毛细管内的残余待测样品推出；用去离子水洗涤1次
97.步骤5，向毛细管内注入100微升的醋酸铵溶液，并静置10秒钟，使蛋白质充分地从毛细管内表面解吸附下来；
98.步骤6，将毛细管放置于离子化装置上，采用感应式电极进行单细胞离子化，输出波形调节为正弦波，电压频率调节为1000hz，电压vpp为3kv，针尖距离质谱入口2毫米；采用感应式电极，防止毛细管内溶液被污染。
99.步骤7，轨道阱质谱为exactive plus质谱仪(thermofisher scientific，ca，usa)，其采集参数为：质量扫描范围60-900，质量分辨率140000，agc阈值1e6，正离子模式，s-lens射频电平50％，毛细管传输温度275℃，平均谱帧数1帧，采集时间5min。
100.实验结果如图16显示，本方法可以实现磷酸缓冲溶液中钙调蛋白及其复合物的检测，在4um的钙离子浓度条件下，可以观测到钙调蛋白与钙离子发生结合形成ca4cam的蛋白质-离子复合物；加入2um的钙离子(加入氯化钙是为了让cam蛋白与钙离子产生结合)，可以
观测到ca2cam的复合物。而不加入钙离子，则蛋白质以未结合的形态出现。而作为对比，常规电喷雾方法由于受到磷酸缓冲中无机盐的干扰，获得蛋白质的质谱图如图17所示，无法实现蛋白质及其离子结合复合物的信号。
101.实施例3.裂解液中蛋白质的快速检测
102.步骤1，将高表达mini-sog、sfgfp、killerred蛋白的大肠杆菌(将包含蛋白质序列的片段转染进入细菌，并在细菌培养基中加入异丙基硫代半乳糖苷诱导剂诱导蛋白表达，获得相应的高表达蛋白质的大肠杆菌菌株)进行离心，收集细菌后重悬于磷酸缓冲溶液中，用超声波进行裂解，成为待测样品；
103.步骤2，将开口直径为5微米的毛细管插入待测样品中，吸入15纳升的溶液；
104.步骤3，将吸入待测样品的毛细管，静置30秒，使蛋白质充分吸附于毛细管内表面；
105.步骤4，将毛细管内的残余待测样品推出；用去离子水洗涤1次
106.步骤5，向毛细管内注入100微升的1％的甲酸溶液(本次检测的三种蛋白质，均为蛋白质单体，不含蛋白质复合物，采用甲酸作为解吸附溶液，可以最大程度提升检测灵敏度)，并静置10秒钟，使蛋白质充分地从毛细管内表面解吸附下来；
107.步骤6，将毛细管放置于离子化装置上，采用感应式电极进行单细胞离子化，输出波形调节为正弦波，电压频率调节为1000hz，电压vpp为3kv，针尖距离质谱入口2毫米；采用感应式电极，防止毛细管内溶液被污染。
108.步骤7，轨道阱质谱为exactive plus质谱仪(thermofisher scientific，ca，usa)，其采集参数为：质量扫描范围60-900，质量分辨率140000，agc阈值1e6，正离子模式，s-lens射频电平50％，毛细管传输温度275℃，平均谱帧数1帧，采集时间5min；
109.实验结果如图所示，本方法可以在细胞裂解液中获得killerred的26.6kda的蛋白质信号(图18)，能够检测到1fmol的蛋白质；可以获得mini-sog的21kda的蛋白质信号(图19)，可以获得sfgfp的27.3kda蛋白质信号(图20)，能够检测到1fmol的蛋白质。
110.实施例4.细胞裂解液中和蛋白质-配体相互作用的快速检测
111.步骤1，将高表达两种蛋白亚基hif-1α/taz1(hif-1α是缺氧介导因子蛋白的亚结构单元，在细胞的发育和疾病中起着重要作用，通常在癌细胞中高表达。其会受锌指蛋白taz1的调控，控制细胞的发育。taz1会与hif-1α结合，形成调控的蛋白质复合物，检测hif-1α/taz1复合物，有助于理解癌细胞的发生机理)的大肠杆菌进行离心，收集细菌后重悬于磷酸缓冲溶液中，用超声波进行裂解，成为待测样品；
112.步骤2，将开口直径为5微米的毛细管插入待测样品中，吸入15纳升的溶液；
113.步骤3，将吸入待测样品的毛细管，静置30秒，使蛋白质充分吸附于毛细管内表面；
114.步骤4，将毛细管内的残余待测样品推出；用去离子水洗涤1次
115.步骤5，向毛细管内注入100微升的500mm醋酸铵溶液，并静置10秒钟，使蛋白质充分地从毛细管内表面解吸附下来；
116.步骤6，将毛细管放置于离子化装置上，采用感应式电极进行单细胞离子化，输出波形调节为正弦波，电压频率调节为1000hz，电压vpp为3kv，针尖距离质谱入口2毫米；采用感应式电极，防止毛细管内溶液被污染。
117.步骤7，轨道阱质谱为exactive plus质谱仪(thermofisher scientific，ca，usa)，其采集参数为：质量扫描范围60-900，质量分辨率140000，agc阈值1e6，正离子模式，
s-lens射频电平50％，毛细管传输温度275℃，平均谱帧数1帧，采集时间5min；
118.采用醋酸铵溶液作为解吸附溶剂，实验获得蛋白质的质谱图如图21所示，本发明可以在细胞裂解液中检测到低分子量端检测到hif-1α和taz1这两种蛋白质单体的信号，能够检测到1fmol的蛋白质，且在高分子量端可以观测到这两种蛋白质形成的hif-1α/taz1蛋白质复合物的信号。调节步骤5中解吸附溶剂为1％的甲酸溶液，获得蛋白质的质谱图如图22所示，仅能实现细胞裂解液中hif-1α和taz1蛋白质单体的检测，高分子量端的hif-1α/taz1的复合物信号无法观测。说明采用醋酸铵溶液作为解吸附溶剂，本发明可以实现细胞裂解液中蛋白质复合物的检测，能够检测到1fmol的蛋白质，可以保留蛋白与蛋白间的相互作用，实现蛋白质中相互作用的检测。而甲酸则仅能获得蛋白质单体的信号，无法保留相互作用，无法实现蛋白质复合物的检测。
119.seq id no:1mini-sog的氨基酸序列
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123.seq id no:3killerred的氨基酸序列
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125.seq id no:4hif-α的氨基酸序列
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127.seq id no:5taz1的氨基酸序列
128.matgptadpekrkliqqqlvlllhahkcqrreqangevracslphcrtmknvlnhmthcqagkacqvahcassrqiishwknctrhdcpvclplknas
129.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。