基于声表面波-气相色谱联用技术快速分析麝香中麝香酮

1.本发明具体涉及基于声表面波-气相色谱联用技术快速分析麝香中麝香酮。


背景技术：

2.麝香是一味沿用至今的稀贵中药材，为鹿科马麝、林麝或原麝雄体香囊中的干燥分泌物。麝香含有大环化合物如麝香酮、甾族化合物(雌二醇、胆甾醇)等。麝香酮是麝香的主要有效成分之一。麝香酮具有开窍醒神、活血通经、消肿止痛等功效，且具有双向调节中枢神经系统、抗炎、强心、抑制肿瘤细胞，对缺血性心脏障碍有预防和治疗的作用。
3.麝香中麝香酮常用的检测方法有hplc、gc、uv等方法，然而这些方法的检测仪器体积过于庞大，且分析时间较长，一般需要30分钟以上，只适用于实验室分析无法满足现场快检(point-of-care testing，poct)需求。
4.声表面波(surfaceacoustic wave，saw)传感器作为一种声-电换能器，能够在很小的插指换能器中实现。传感器由两个基本相同的saw器件与对应的振荡电路构成。一路振荡器与气相色谱结合，使用精密温控来吸附待测气体，作为测试回路；另一路振荡器则作为参考基准，计算差频后可最大程度上消除外围环境如振动、温度等对于振荡器频率稳定性的影响。声表面波传感器面积仅12mm2，因此检测器体积相对较小。
5.声表面波传感器与气相色谱仪联用是21世纪初期发展起来的一种新型的分析技术，具有反应速度快(整个分析过程只需2分钟左右)、检测灵敏度高(对于挥发性、半挥发性有机化合物最低检测限可达到pg级)、信息量大(可同时检测十几个乃至几十个组分)便携性好等特点。而中药绝大多数来源于植物、动物，大多含有不同程度的挥发性成分，有其特殊的气味。是传统中药鉴别方法“眼看、手摸、口尝、鼻闻”所依据的重要物质基础。应用声表面波传感器与气相色谱仪联用技术的对中药进行现场快速检测，就是将传统中药鉴别经验实现仪器化，既能保留经验鉴别简易、快速的优点，又能实现鉴别指标更科学、鉴别结论更可靠。
6.但正是由于声表面波-气相色谱联用检测时间更短，检测限更低，相对普通的气相色谱检测在短时间内更难将中药中复杂的挥发性成分有效分离，实现准确检测，因此，目前还没有针对基于声表面波-气相色谱联用技术快速分析麝香的报道。


技术实现要素：

7.为解决上述问题，本发明提供了一种麝香中麝香酮的检测方法，它是采用声表面波-气相色谱法检测，具体步骤如下：
8.1)标准溶液制备：取麝香酮标准品，加甲醇稀释成系列浓度的标准品溶液；
9.2)供试品溶液的制备：取待测样品，加乙醇提取，过滤，滤液再加乙醇稀释50～150倍，即得供试品溶液；
10.3)分别吸取标准品溶液和供试品溶液注入声表面波-气相色谱仪，色谱条件如下：db-5色谱柱；色谱柱程序升温：初始温度45℃，10℃/s升温至180℃；进样口200℃；阀温160
℃。
11.进一步地，步骤1)所述标准品溶液的浓度为0.2、0.4、0.8、1.6和/或3.2μg/ml。
12.进一步地，步骤2)所述待测样品与乙醇的质量体积比为10～30mg：5ml。
13.进一步地，步骤2)所述加乙醇稀释100倍。
14.更进一步地，所述乙醇为无水乙醇。
15.进一步地，步骤3)所述色谱柱规格为：1m
×
0.25mm
×
0.25μm；所述色谱条件还包括：载气流量2～6ml/min，检测器38～42℃，泵吸8～12s，进样量0.05～0.15μl。
16.更进一步地，所述色谱条件还包括：载气流量4ml/min，检测器40℃，泵吸10s，进样量0.1μl。
17.进一步地，所述待测样品溶液的色谱图中呈现与标准品溶液的色谱图中保留时间一致的色谱峰，确定待测样品中含有麝香酮。
18.本发明还提供了一种麝香中麝香酮的含量测定方法，它包括如下步骤
19.1)取麝香样品，按照前述方法检测；
20.2)以系列浓度标准溶液的浓度和色谱峰峰面积建立标准曲线，根据标准曲线得到麝香样品中麝香酮含量。
21.本发明使用中国科学院声学研究所与四川省中医药科学院联合研制的气相色谱-声表面波联用技术(gc-saw)对麝香进行快速检测，其具体的原理框图见图1。在采集阶段，样品通过采样泵进入预浓缩管，在预浓缩管麝香样品挥发性成分被吸收；在进样分析阶段，切换六通阀，载气瓶中的氮气把预浓缩管中采集到的样品带入色谱柱，化合物进入色谱柱，采用柱上升温系统，使得色谱柱升温速率较快，达到10℃/s，不同化合物在色谱柱分离效果会不一样，其到达检测器的时间也会不同，根据化合物出峰时间进行定性分析，不同质量的化合物会引起检测器频率发生改变，根据检测器频率的变化量可对物质进行定量分析。
22.使用本发明方法可在几十秒内实现快速检测，取样量也只需要不到50mg，待测的麝香酮在皮克级、纳克级显示出良好的灵敏度。因此，本发明方法可以作为一种简单、快速、高灵敏度的分析方法替代常用的hplc、gc、uv等方法。
23.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
24.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
25.图1声表面波气相色谱仪原理框图
26.图2 1.6μg/ml麝香酮标准溶液测试色谱图
27.图3麝香酮不同浓度响应标准曲线
28.图4 1号麝香样品测试色谱图
具体实施方式
29.实施例1、本发明麝香中麝香酮含量测定
30.1)标准溶液制备：取浓度为100mg/ml麝香酮标准品，加甲醇逐级稀释，分别配制含量为0.2、0.4、0.8、1.6和3.2μg/ml的麝香酮标准溶液；
31.2)供试品溶液的制备：取干燥的麝香样品20mg放入试剂瓶中，加入5ml无水乙醇，超声30min后，使用0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，取20μl于2ml无水乙醇中，得到供试品溶液；
32.3)分别吸取标准品溶液和供试品溶液注入声表面波-气相色谱仪，色谱条件如下：进样口200℃，阀温160℃，db-5色谱柱(1m
×
0.25mm
×
0.25μm)45-180℃，10℃/s程序升温，载气流量4ml/min，检测器40℃，泵吸10s，进样量0.1μl；
33.4)以系列浓度标准溶液的浓度和色谱峰峰面积建立标准曲线，将麝香样品中麝香酮色谱峰峰面积代入标准曲线，计算得到麝香样品中麝香酮含量。
34.以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
35.试验例1
36.1、材料与方法
37.1.1实验耗材与设备
38.声表面波气相色谱仪：中国科学院声学研究所。恒温加热器：厦门宇电科技有限公司。
39.高纯氮气(99.999％)，北京兆格气体科技有限公司；乙醇(≥99.5％，tedia)；麝香酮标准溶液(100mg/ml)，国家标准物质研究中心。s1-s16麝香样品：由四川省中医药科学院方清茂研究员鉴定为中药麝香正品。
40.1.2实验方法
41.1.2.1麝香酮标准品的配制
42.标准品配制：取浓度为100mg/ml麝香酮标准品，经过甲醇逐级稀释，分别配制含量为0.2、0.4、0.8、1.6和3.2μg/ml的麝香酮标准溶液。
43.1.2.2样品的前处理
44.样品前处理：取干燥的麝香样品20mg放入试剂瓶中，加入5ml无水乙醇，超声30min后，使用0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，取20μl于2ml无水乙醇中，得到待测样品。
45.1.2.3仪器条件
46.gc-saw测试条件：进样口200℃，阀温160℃，db-5(1m
×
0.25mm
×
0.25μm)色谱柱45-180℃，10℃/s程序升温，载气流量4ml/min，检测器40℃，泵吸10s，进样量0.1μl。
47.2、结果与讨论
48.2.1色谱分离及定性
49.取浓度为1.6μg/ml麝香酮标准溶液，使用gc-saw测试，进样0.1μl，并以保留时间对其定性。麝香酮标准溶液测试色谱图见图2，在1.5s的峰为甲醇溶剂峰，麝香酮保留时间为6.62s，麝香酮在7s内快速出峰，且峰形较好。
50.2.3标准曲线与检出限
51.取含量为0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml、1.6μg/ml和3.2μg/ml的麝香酮标准系列，在1.2.3的色谱条件下分析，以麝香酮的浓度对其响应值(峰面积)均值绘制标准曲线。线性回归曲线方程为y＝1830.3x+364.88，相关系数r＝0.9987，在0.2～3.2μg/ml范围内呈良好的线性关系(图3)。
52.依据校准曲线的偏差和斜率方法计算麝香酮检测限和定量限，根据已知标准曲线已知浓度的响应值，使用excel中的linest函数和检出限公式如下：
53.检测限dl＝3.3σ/s
54.定量限ql＝10σ/s
55.(σ——标准偏差；s——斜率)
56.计算得到麝香酮检出限为0.158μg/ml，进样量为0.1ul，即检出限绝对质量为15.8pg。
57.计算麝香酮定量限为0.478μg/ml,进样量为0.1ul，即定量限绝对质量为47.8pg。
58.2.3精密度实验
59.对三种浓度0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml麝香酮标准溶液分别连续测定6次，计算相对标准偏差(rsd)分别为3.24％、3.09％和2.89％(见表1)。测试结果表明该方法的精密度良好。
60.表1不同浓度麝香酮标液精密度测试数据(n＝6)
[0061][0062]
2.4重复性实验
[0063]
取配制好的6瓶浓度为0.8μg/ml麝香酮标准溶液，每瓶测定2次，计算组间的相对标准偏差rsd值。测试结果见表2。测试六瓶麝香酮重复性rsd值为4.69％，表明该方法的重复性较好。
[0064]
表2 0.8μg/ml麝香酮甲醇溶液重复性测试(n＝6)
[0065][0066]
2.5稳定性试验
[0067]
取配制好的浓度为0.8μg/ml麝香酮溶液，放置0h、2h、4h、8h、12h、24h后分别测定其响应，结果显示，其rsd值为4.4％，表明该溶液在24h内稳定。
[0068]
表3 0.8μg/ml麝香酮甲醇溶液稳定性测试
[0069][0070]
2.6加样回收率实验
[0071]
1号麝香样品干燥，取约10mg，共平行6份，分别置于试剂瓶中，各加入100mg/ml麝香酮标准品溶液3.5μl，再加入无水乙醇5ml，超声30min后，使用0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，取20μl于2ml无水乙醇中，得到待测样品。进样0.1μl测试。计算回收率，结果如表4所示，平均回收率为96.23％，rsd为4.53％。
[0072]
表4不同浓度麝香酮标液加样回收率测试数据(n＝6)
[0073][0074]
2.7中药麝香样品测试
[0075]
根据测试条件1.2.3，测试16组不同产地、不同年龄段和不同品种的麝香样品，每组测试2次，测试结果如图4和表5所示。
[0076]
表5 16组样品中麝香酮含量测试结果(n＝2)
[0077]
[0078][0079]
测试16组不同产地、不同品种、不同年龄段的麝香样品，其麝香酮含量在2.08％-3.83％范围内，含量均高于药典要求的2％。从测试结果分析，不同产地、不同品种、不同年龄段的麝香酮含量差异较大。四川圭兴林麝中麝香酮含量最高，且三年生林麝高于一年生林麝，一年生麝香酮含量为3.54％，三年生麝香酮含量为3.83％。陕西凤县一年生林麝的麝香酮含量最低，为2.08％。三年生的林麝和马麝中麝香酮含量均大于一年生，说明麝香生长年份越长，麝香酮含量越高。不同产地、不同年龄段的马麝和林麝麝香酮含量差异不明显。
[0080]
3、结论
[0081]
本发明首次应用声表面波气相色谱联用技术对麝香中主要成分麝香酮探索性地进行检测，采用柱上升温系统，7s内可检出麝香酮。使用声表面波气相色谱联用技术实现了对麝香酮定性、定量检测，且具有较好的响应特性、精密度、重复性和稳定性。通过液体进样对麝香酮进行定量分析，定量测定在0.2～3.2μg/ml范围内有较好的线性，麝香酮的最低检出限为15.8pg。测试16组麝香样品，麝香酮含量最高的为四川圭兴林麝，含量最低的为陕西凤县林麝，三年生的麝香酮含量均大于一年生，与中草药报道的爵香产量从麝一岁到三岁半呈递增速度相符合。麝香酮作为麝香质量的控制指标之一，采用gc-saw对麝香中主要成分麝香酮进行定量分析，可用于指导中药麝香质量评价。
[0082]
本发明分析gc-saw在检测麝香酮定量分析的潜在应用，为中药麝香现场检测快检提供一种新的分析技术。在此研究的基础上与中国药典方法进行比较，中国药典中使用传统气相色谱法测试麝香酮含量，测试一个样品需要30分钟以上，取样量需要为200mg，而gc-saw分析方法可在几十秒内可实现快速检测，取样量只需要20mg，在皮克级、纳克级显示出良好的灵敏度。因此，gc-saw新方法可以作为分析中药麝香的替代分析技术，提供简单、快速、高灵敏度的分析方法。