一种替诺福韦及有关物质的高效液相色谱分析检测方法与流程

1.本发明涉及一种替诺福韦及其有关物质的hplc检测方法，属于药物检测技术领域。


背景技术：

2.富马酸替诺福韦二吡呋酯(tdf)是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，由吉利德公司研究开发，美国fda分别于2001年和2008年批准其用于治疗艾滋病(hiv)和成人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis b，chb)。国内外的多项研究显示，tdf具有强大的抗hbv作用及低耐药性，对多种nas治疗失败的chb患者均有效，被美国肝病学会及欧洲肝病学会指南等国内外众多指南推荐为一线治疗药物。
3.替诺福韦是富马酸替诺福韦二吡呋酯合成过程中的关键中间体，它经过酯化和成盐两步后即可得到富马酸替诺福韦二吡呋酯。对于富马酸替诺福韦二吡呋酯，目前进口注册标准中对其有关杂质的限量有要求，所以在合成过程中，开发具有专属性的方法来检测控制中间体替诺福韦的有关物质含量，并制定合理可行的有关物质杂质限度，是替诺福韦中间体质量控制的重要部分，也是保证富马酸替诺福韦二吡呋酯及其制剂产品质量的重要部分。
4.通过查阅大量中外文献及专利，有一些文献对替诺福韦的分析方法进行了说明，但是已有方法的分离能力有限，不能将替诺福韦和8个有关物质杂质分开；其中授权公布号“cn112782311a”的专利，用type b封端的c18的色谱柱，乙腈和ph7.9～8.1的磷酸二氢钾为流动相可以将富马酸丙酚替诺福韦中的l-丙氨酸异丙酯检测出来；该方法无法将本发明所述的8个替诺福韦杂质和主峰完全分离；授权公布号“cn107655987b”的专利，用十八烷基硅烷键合硅胶填料柱，甲醇和酸水为流动相可以将替诺福韦艾拉酚胺及其异构体分开，该方法无法分离出替诺福韦及8个有关物质杂质。


技术实现要素：

5.针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种简便、效率、经济和适用的hplc检测分析替诺福韦及其有关物质的方法，该方法采用亚乙基桥键合十八烷基杂化硅胶填料色谱柱，以甲醇和ph6.5的盐溶液作为流动相，在一定条件下进行梯度洗脱，能够有效分离替诺福韦及其有关的8种物质杂质。
6.本发明提供的技术方案如下：
7.一种检测分析替诺福韦及其有关物质杂质的方法，采用高效液相色谱，色谱条件如下：
8.色谱柱填料：亚乙基桥键合十八烷基杂化硅胶填料色谱柱；
9.紫外检测器，检测波长：260nm；
10.柱温：25-45℃；
11.样品配制溶剂：水或10％～50％甲醇水溶液；
12.流速：0.6ml/min-1.5ml/min；
13.流动相：a相为甲醇，b相为ph 6.5的盐溶液；
14.洗脱条件：0～30min，a/b比例由低到高梯度条件；
15.所述方法用于检测分析替诺福韦及其有关物质杂质：
[0016][0017]
进一步，所述盐溶液的浓度为20mmol/l～50mmol/l。优选的浓度为20～30mmol/l。
[0018]
进一步，所述盐溶液为磷酸氢二钠，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾中的一种或几种混合。
[0019]
该盐溶液使用磷酸或0.1mol/l的氢氧化钠调ph至6.5。
[0020]
进一步，样品进样量为10μl。
[0021]
进一步，所述柱温为35-40℃。
[0022]
进一步，所述流速为1.0ml/min-1.5ml/min。
[0023]
进一步，所述色谱柱柱长为100mm～250mm，色谱柱的粒径≤5um。
[0024]
进一步，洗脱程序为：
[0025][0026]
进一步，洗脱程序为
[0027][0028]
进一步，所述替诺福韦及其8个有关物质杂质之间的分离度大于2。
[0029]
进一步，所述替诺福韦及其8个有关物质杂质的理论踏板数均≥5000。
[0030]
本发明的有益效果如下：
[0031]
本发明使用的高效液相色谱法能够有效分离测定替诺福韦及其8个有关物质杂质，并且该方法分离度良好，结果准确，可用于替诺福韦生产过程的质量控制。
附图说明
[0032]
图1为实施例1中替诺福韦和8个杂质的hplc分析图。
[0033]
图2为实施例2中替诺福韦和8个杂质的hplc分析图。
[0034]
图3为实施例3中替诺福韦和8个杂质的hplc分析图。
[0035]
图4为实施例4中替诺福韦和8个杂质的hplc分析图。
[0036]
图5为实施例5中替诺福韦和8个杂质的hplc分析图。
具体实施方式
[0037]
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0038]
实施例1
[0039]
仪器与高效液相色谱条件：
[0040]
高效液相色谱仪：waters高效液相色谱系统与工作站；
[0041]
色谱柱：xbridgec18(4.6
×
250mm，5μm)；
[0042]
流动相：以20mmo/l磷酸二氢钾缓冲液(ph6.5)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0043]
洗脱程序为：
[0044][0045]
检测波长：260nm；
[0046]
流速：1.0ml/min；
[0047]
柱温：35℃；
[0048]
实验步骤：
[0049]
分别取杂质1～杂质8对照品与替诺福韦适量，用10％甲醇溶液配制成每1ml中含替诺福韦50μg，含其余杂质对照品各10μg的混合溶液；
[0050]
取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1。替诺福韦与各杂质均能达到完全分离。
[0051]
实施例2
[0052]
仪器与高效液相色谱条件：
[0053]
高效液相色谱仪：thermo u3000高效液相色谱系统与工作站；
[0054]
色谱柱：xbridgec18(4.6
×
250mm，5μm)；
[0055]
流动相：以30mmo/l(摩尔比磷酸二氢钾：磷酸氢二钠＝9：1)缓冲液(ph6.5)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0056]
洗脱程序为：
[0057][0058]
检测波长：260nm；
[0059]
流速：1.0ml/min；
[0060]
柱温：35℃。
[0061]
实验步骤：
[0062]
分别取杂质1～杂质8对照品与替诺福韦适量，用10％甲醇溶液配制成每1ml中含替诺福韦50μg，含其余杂质对照品各10μg的混合溶液；
[0063]
取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1。替诺福韦与各杂质均能达到完全分离。
[0064]
实施例3
[0065]
仪器与高效液相色谱条件：
[0066]
高效液相色谱仪：waters高效液相色谱系统与工作站；
[0067]
色谱柱：xbridgec18(4.6
×
250mm，5μm)；
[0068]
流动相：以30mmo/l(摩尔比磷酸二氢钾：磷酸氢二钠＝9：1)混合缓冲液(ph6.5)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0069]
洗脱程序为：
[0070][0071]
检测波长：260nm；
[0072]
流速：1.0ml/min；
[0073]
柱温：40℃。
[0074]
实验步骤：
[0075]
分别取杂质1～杂质8对照品与替诺福韦适量，用10％甲醇溶液配制成每1ml中含替诺福韦50μg，含其余杂质对照品各10μg的混合溶液；
[0076]
取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1。替诺福韦与各杂质均能达到完全分离。
[0077]
实施例4
[0078]
仪器与高效液相色谱条件：
[0079]
高效液相色谱仪：waters高效液相色谱系统与工作站；
[0080]
色谱柱：xbridgec18(4.6
×
250mm，5μm)；
[0081]
流动相：以20mmo/l磷酸二氢钾缓冲液(ph6.5)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0082]
洗脱程序为：
[0083][0084]
检测波长：260nm；
[0085]
流速：1.0ml/min；
[0086]
柱温：40℃。
[0087]
实验步骤：
[0088]
分别取杂质1～杂质8对照品与替诺福韦适量，用10％甲醇溶液配制成每1ml中含替诺福韦50μg，含其余杂质对照品各10μg的混合溶液；
[0089]
取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1。替诺福韦与各杂质均能达到完全分离。
[0090]
实施例5
[0091]
仪器与高效液相色谱条件：
[0092]
高效液相色谱仪：thermo u3000高效液相色谱系统与工作站；
[0093]
色谱柱：xbridgec18(4.6
×
250mm，5μm)；
[0094]
流动相：以20mmo/l(摩尔比磷酸二氢钾：磷酸氢二钾＝9：1)缓冲液(ph6.5)为流动相a，以甲醇为流动相b；
[0095]
洗脱程序为：
[0096][0097]
检测波长：260nm；
[0098]
流速：1.0ml/min；
[0099]
柱温：35℃。
[0100]
实验步骤：
[0101]
分别取替诺福韦、杂质1～杂质8对照品与替诺福韦适量，用10％甲醇溶液配制成每1ml中含替诺福韦50μg，含其余杂质对照品各10μg的混合溶液；
[0102]
取混合液，注入液相色谱仪，记录色谱图。替诺福韦与各杂质均能达到完全分离。
[0103]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。