一次，150d。
[0019](5)定期取样:在层积0、20、35、50、65、80、95、110、130、150d定期取样，用流水冲洗种沙混合物，去沙留种。
[0020]3.样品固定:将洗净的种子用吸水纸吸干种子表面水分，剥去种皮，将种子迅速放入盛有FAA固定液的青霉素药瓶中固定，4°C冰箱放置，固定24-72h。FAA固定液组成为:浓度38%甲醛、冰醋酸和浓度70%乙醇，三者体积比为1:1:18o
[0021]4.脱水:固定的材料依次经过65% — 75% — 85% — 95% — 100% — 100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱水，每个浓度梯度脱水时间依次2h — 1.5h — 1.5h — lh，100%乙醇分两次进行，第一次30min，第二次15min。
[0022]5.透明:经4/5无水乙醇+1/5 二甲苯一3/5无水乙醇+2/5 二甲苯一2/5无水乙醇+3/5 二甲苯一1/5无水乙醇+4/5 二甲苯一纯二甲苯一纯二甲苯，不断增加二甲苯的体积比例，逐级透明，每级透明时间为1.5h，纯二甲苯透明时间第一次40min，第二次20min。
[0023]6.浸蜡:将材料透明彻底的小瓶倒出1/2或2/3的二甲苯，然后将低熔点的石蜡蜡肩(熔点为52-54°C)放入小瓶中，一直加到二甲苯完全饱和，在40°C条件的恒温箱中浸蜡24h。然后用混合蜡液(由熔点为58-60°C和熔点为50-52°C的石蜡1:1混合)在恒温箱中60°C保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，浸蜡72-120h。
[0024]7.包埋:材料浸蜡结束后立即用镊子轻轻转移到装有液态上述混合石蜡的小纸盒中，调整好材料位置，再将小纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却，待蜡液表面凝固后，迅速倒扣纸盒沉入水中，然后让其自然漂浮于水中，防止产生结晶。
[0025]8.切片:根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成小梯形，然后粘到切片机的錯台上进行切片，切片厚度6-8Mm。
[0026]9.粘片:在洁净的载玻片上均匀涂薄层质量体积比为2%明胶，将蜡带小心地放载玻片上，可以用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置，待蜡带展平后，将载玻片放在30-35?水浴锅上2h，使蜡带光面紧贴载玻片。之后再将载玻片放入38°C烘箱中烘干。
[0027]10.脱蜡:在染色缸中用纯二甲苯30°C保温脱蜡40min，之后倒掉二甲苯，晾干切片。
[0028]11.封片:切片从染色缸中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴I滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除。封好的切片放入40°C恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。
[0029]12.镜检和照相:将切片置于Motic显微镜下观察并照相，将合格的切片贴上标签，以便再次观察和照相。
【主权项】
1.一种天女木兰种子石蜡切片方法，其特征在于按如下步骤进行: (O取材与固定 种子选取:将去除假种皮的饱满的天女木兰种子用浓度0.2%高锰酸钾溶液消毒30min，用流水冲洗干净； 样品固定:将洗净的种子用吸水纸吸干种子表面水分，剥去种皮，将种子迅速放入盛有FAA固定液的小瓶中固定，4°C冰箱放置，固定24-72h ； (2)脱水:固定的材料依次经过65%— 75% — 85% — 95% — 100% — 100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱水，每个浓度梯度脱水时间依次2h — 1.5h — 1.5h — Ih — 30min — 15min ； (3)透明:经4/5无水乙醇+1/5二甲苯一3/5无水乙醇+2/5 二甲苯一2/5无水乙醇+3/5 二甲苯一1/5无水乙醇+4/5 二甲苯一纯二甲苯一纯二甲苯，不断增加二甲苯的体积比例，逐级透明，每级透明时间依次为1.5h — 1.5h — 1.5h — 1.5h — 40min — 20min ； (4)浸蜡:将材料透明彻底的小瓶倒出1/2或2/3的二甲苯，然后将熔点为52-54°C的石蜡蜡肩放入小瓶中，一直加到二甲苯完全饱和；在401下浸蜡24h，之后再用混合石蜡在温箱中60°C保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，浸蜡72-120h ;混合蜡液是由熔点为58-60°C和熔点为50-52°C的石蜡按重量比1:1的比例融合而成； (5)包埋:材料浸蜡结束后马上用镊子轻轻转移到装有液态混合石蜡的小纸盒中，调整好材料位置，再将小纸盒放在盛有冰水的盆中迅速冷却，待蜡液表面凝固后，迅速倒扣纸盒沉入水中，然后让其自然漂浮于水中，防止产生结晶； (6)切片:根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成小梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片，切片厚度6-8Μπι; (7)粘片:在洁净的载玻片上均匀涂薄层质量体积比为2%明胶，将蜡带小心地放载玻片上，用蘸有水的毛笔移动蜡带以调整位置，待蜡带展平后，将载玻片放在30-35?水浴锅上2h，使蜡带光面紧贴载玻片；之后再将载玻片放入38°C烘箱中烘干； (8)脱蜡:在染色缸中用纯二甲苯30°C保温脱蜡40min，之后倒掉二甲苯，晾干切片； (9)封片:切片从染色缸中取出，待二甲苯未挥发完全之前，在材料中央滴I滴中性加拿大树胶，将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上，慢慢放下盖玻片并将空气完全排除；封好的切片放入40°C恒温箱中干燥过夜，制成永久切片。
2.根据权利要求1所述的天女木兰种子石蜡切片方法，其特征在于:FAA固定液组成为:浓度38%甲醛、冰醋酸和浓度70%乙醇，三者体积比为1:1:18o
【专利摘要】一种天女木兰种子石蜡切片方法，其步骤如下：取材；FAA固定液固定；65%到100%系列浓度的乙醇溶液逐级脱水；无水乙醇到纯二甲苯逐级透明；将低熔点的石蜡蜡屑放入盛有1/2二甲苯的小瓶中，直到二甲苯完全饱和，在40℃下浸蜡24h，然后用由混合石蜡在温箱中60℃保温浸蜡，每天换两次混合蜡液，共72-120h；包埋；进行厚度6-8μm切片；2%明胶粘片，在35℃水浴锅上2h展片，之后再将载玻片放入38℃烘箱中烘干；用纯二甲苯30℃保温脱蜡40min，晾干切片；中性加拿大树胶封片。本发明能较好的固定天女木兰种子细胞组织，切片完整，清晰，易于观察，操作简单。
【IPC分类】G01N1-28
【公开号】CN104614211
【申请号】CN201510022858
【发明人】陆秀君, 梅梅, 孙晓梅, 张丽杰, 王玉涛, 马蓓蓓, 张晓林
【申请人】沈阳农业大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月19日