活性染色方法
【专利说明】活性染色方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月2日提交的共同未决的美国临时专利申请号61/641，805 和2013年3月14日提交的共同未决的美国临时专利申请号61/784, 759的优先权和权益， 将各申请的全部内容通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明总体上涉及检测细胞样品中的活细胞的系统和方法，并且特别涉及使用可 透过膜的渗透活细胞和非活细胞两者的荧光标记物以及不可透过膜的选择性地渗透非活 细胞的淬灭剂来检测细胞样品中的活细胞的系统和方法。
[0004] 背景
[0005] 例如由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、以及真菌（例如酵母菌和霉菌）造成的微生 物污染可以导致严重的疾病，并且在一些情况下甚至导致人类和动物受试者中的死亡。在 某些产业例如食品、水、化妆品、制药、以及医疗器械产业中的生产商必须符合严格的标准 验证他们的产品不包含一定水平的微生物污染物，否则会损害消费者或接受者的健康。这 些产业需要针对微生物污染物的存在进行频繁的、准确的、和灵敏的测试，以符合某些标 准，例如由美国食品与药品管理局或美国环境保护局规定的标准。
[0006] 取决于情况，区分活细胞与非活细胞的能力还可以是重要的。例如，在药物制剂和 生物制剂的生产期间，重要的是在生产过程中使用的水是无菌的并且不含污染物。并且，重 要的是在药物（例如，液体药物制剂和生物剂型，例如可注射的剂型）中包含的水以及例如 经由非肠胃外途径给予至受试者的液体（例如，盐水）也是无菌的并且不含污染物。在另一 方面，在饮用水中一些活微生物的存在可以被接受为直到达到一个点。为了适于饮用，饮用 水必须符合严格标准。即使微生物可以存在于供水中，该水可依然对于人类消费来说是可 接受的。然而，一旦细胞数超过一个阈值水平，该水可能不再被视为对人类消费是安全的。 并且，在某些食物产品（例如，生鲜产品）和饮品（例如，牛奶）中某些预定水平的微生物 的存在可以是可接受的。然而，一旦已经超过那些水平，食物或饮品可被视为已经变质并且 对于人类消费不再是适当的和/或安全的。
[0007] 用于评估微生物污染的存在和/或微生物污染的程度的传统的细胞培养方法可 以耗费几天来进行，这取决于测试针对的微生物。在此期间，存在怀疑的产品（例如，食物、 饮品、或医疗产品）可以被检疫隔离，直至结果获得并且产品可以释放。因此，存在一种快 速检测（例如，在数小时之内或更短）样品中的微生物污染物特别是活的微生物污染物的 存在和/或量的系统和方法的需求。
[0008] 概述
[0009] 本发明部分地是基于可以用于选择性地标记包含细胞的样品中的活细胞（例如， 原核细胞或真核细胞）的染色方法的发现。该染色方法可以与一种细胞捕获系统和/或光 学检测系统组合使用以检测细胞样品中活细胞的存在。可替代地，该染色程序可以用于对 布置于液体内和/或固体支撑物上（例如，在显微镜载玻片上，或培养皿、微量滴定板或吸 收池中）的活细胞进行染色。并且，该染色程序可以用于对溶液中的细胞进行荧光标记（例 如，在流式细胞术之前）。该染色方案可以用于一种用以测量感兴趣的特定样品的生物负载 (例如，用以测量一种样品中的活细胞（例如，活的微生物，如细菌、酵母菌、以及真菌）的数 目和/或百分比和/或分数）的方法中。
[0010] 在一方面，本发明提供了检测细胞样品中的活细胞的方法。该方法包括将该细胞 样品中的细胞（i)在允许一种可透过膜的荧光染料渗透活细胞与非活细胞两者的条件下， 暴露于该荧光染料，并且（ii)在允许一种不可透过膜的荧光淬灭剂选择性地渗透非活细 胞而不是活细胞的条件下，暴露于该淬灭剂，该淬灭剂能淬灭由该荧光染料产生的荧光。例 如，该淬灭剂选择性地渗透非活细胞而不是活细胞。此后，该方法包括将细胞暴露于光，例 如一束具有一个波长的能够激发荧光染料产生荧光发射的光，并且用一个检测器对来自细 胞的荧光发射（如果有的话）进行检测，由此检测细胞样品中的活细胞。在选择的检测条 件下，与活细胞内的荧光染料相比，在非活细胞内的荧光染料发射显著更少的荧光。因此， 与活细胞相比，非活细胞发射显著更少的荧光。
[0011] 在某些情况下，例如，当淬灭剂能够产生荧光发射时，激发光的波长可以被选择为 对该淬灭剂不进行光激发或基本上不进行光激发。可替代地，这种或这些检测器可以被选 择和/或配置为优先检测来自染料的发射事件而非来自淬灭剂的发射事件。
[0012] 在另一方面，本发明提供了检测细胞样品中的活细胞的方法。该方法包括将该细 胞样品中的细胞（i)在允许一种可透过膜的突光染料渗透活细胞与非活细胞两者的条件 下，暴露于该荧光染料，并且（ii)在允许一种不可透过膜的荧光淬灭剂选择性地渗透非活 细胞而不是活细胞的条件下，暴露于该淬灭剂，该淬灭剂能淬灭由该荧光染料产生的荧光。 此后，这些细胞暴露于具有一个波长的光，该波长能够激发荧光染料产生荧光发射。用一种 检测器对来自细胞的荧光发射（如果有的话）进行检测，这些检测器被配置为优先检测来 自荧光染料的可检测发射而不是来自淬灭剂的可检测发射，从而使得来自淬灭剂的可检测 发射（如果产生的话）不高于来自荧光染料的可检测发射的50% (例如，不高于40%、不 高于30%、不高于20%、不高于10% )。在采用的检测条件下，与活细胞相比，非活细胞发 射由检测器检测到的显著更少的荧光。因此，该方法可以用于检测细胞样品中的活细胞。
[0013] 在某些实施例中，在暴露于光时，非活细胞不发射或基本上不发射可由检测器检 测的荧光。在某些实施例中，在暴露于用于激发荧光染料的光时，非活细胞不发射或基本上 不发射荧光。
[0014] 在前述方面和实施例的每一个中，取决于正被检测的细胞和希望的灵敏度，可能 的是将细胞暴露于多种不同荧光染料和/或多种不同荧光淬灭剂中。并且，取决于待使用 的染料和淬灭剂、以及待检测的细胞，可以将这些细胞暴露于荧光染料中并且然后暴露于 荧光淬灭剂中。可替代地，可以同时将这些细胞暴露于荧光染料和荧光淬灭剂中。在某些 方法中，可以希望的是通过在采用用以激发荧光染料的光进行照射之前对这些细胞进行洗 涤来减少任意的背景荧光。在其他方法中，后续的洗涤步骤是不必要的，并且洗涤步骤如果 采用的话可以通过经由扩散到细胞外面而从活细胞去除荧光染料。
[0015] 检测方法可以在单一的细胞、细胞簇或细胞集落上进行。在某些情况下，例如，为 了增加测定的灵敏度，可以希望的是在将细胞暴露于荧光染料和荧光淬灭剂之前和/或期 间和/或之后，在允许细胞增殖的条件下培养细胞。包括生长培养基、温度、培养持续时间 的选择的培养条件可以被选择为允许样品中的至少一种细胞具有一次或多次细胞分裂。
[0016] 在前述方面和实施例的每一个中，荧光染料和/或荧光淬灭剂结合至细胞内的细 胞组分或细胞器，例如，核酸。在其他实施例中，荧光染料和荧光淬灭剂在细胞中与彼此结 合。
[0017] 在前述方面和实施例的每一个中，用于激发该荧光染料或这些荧光染料的该束光 具有在以下的范围内的波长：从大约350nrn至大约lOOOnm、从大约350nm至大约900nrn、 从大约350nm至大约800nm、从大约350nm至大约700nm、或从大约350nm至大约600nm。例 如，激发光的波长是至少处于以下的一个范围内：从大约350nm至大约500nm、从大约350nm 至大约550nm、从大约350nm至大约600nm、从大约400nm至大约550nm、从大约400nm至大 约600nm、从大约400nm至大约650nm、从大约450nm至大约600nm、从大约450nm至大约 650nm、从大约450nm至大约700nm、从大约500nm至大约650nm、从大约500nm至大约700nm、 从大约500nm至大约750nm、从大约550nm至大约700nm、从大约550nm至大约750nm、从大 约550nm至大约800nm、从大约600nm至大约750nm、从大约600nm至大约800nm、从大约 600nm至大约850nm、从大约650nm至大约800nm、从大约650nm至大约850nm、从大约650nm 至大约900nm、从大约700nm至大约850nm、从大约700nm至大约900nm、从大约700nm至大 约950nm、从大约750至大约900nm、从大约750至大约950nm或从大约750至大约lOOOnm。 某些范围包括从大约350nm至大约600nm以及从大约600nm至大约750nm。
[0018] 取决于采用的一种或多种荧光标记物，光学检测器可以检测处于以下范围内的 发射光：从大约350nm至大约lOOOnm、从大约350nm至大约900nm、从大约350nm至大约 800nm、从大约350nm至大约700nm、或从大约350nm至大约600nm。例如，可以检测处于以 下范围内的焚光发射：从大约350nm至550nm、从大约450nm至大约650nm、从大约550nm 至大约750nm、从大约650nm至大约850nm、或从大约750nm至大约950nm、从大约350nm至 大约450nm、从大约450nm至大约550nm、从大约550nm至大约650nm、从大约650nm至大约 750nm、从大约750nm至大约850nm、从大约850nm至大约950nm、从大约350nm至大约400nm、 从大约400nm至大约450nm、从大约450nm至大约500nm、从大约500nm至大约550nm、从大 约550nm至大约600nm、从大约600nm至大约650nm、从大约650nm至700nm、从大约700nm 至大约750nm、从大约750nm至大约800nm、从大约800nm至大约850nm、从大约850nm至大 约900nm、从大约900nm至大约950nm、或从大约950nm至大约lOOOnrn。在某些实施例中，检 测到处于以下范围的发射光：从大约660nm至大约690nm、从大约690nm至大约720nm、和/ 或从大约720nm至大约850nm。
[0019] 在前述方面和实施例的每一个中，这些细胞被捕获在多孔膜上，例如，在此所述的 细胞捕获系统的多孔膜上。该多孔膜当暴露于具有一个处于从大约350mn至大约1000 nm 范围内的波长的光时可以基本上是非自发荧光的。在某些其他实施例中，这些细胞被布置 于固体支撑物例如显微镜载玻片上。在某些其他实施例中，这些细胞被布置在液体样品中， 该液体样品可以存在于光学池例如流动池或毛细管中。
[0020] 在前述方面和实施例的每一个中，该方法可以进一步包括将细胞暴露于第二不同 的可透过膜的对活细胞、非活细胞或活细胞与非活细胞组合进行标记的焚光染料。
[0021] 此外，在前述方面和实施例的每一个中，有可能包括用于检测系统的阳性对照。因 此，该方法可以进一步包括将包含这些细胞的样品或流体中的这些细胞与多种颗粒例如荧 光颗粒进行组合中，这些颗粒在被一束具有从大约350nm至大约1000 nm范围内（例如，上 文结合针对一种或多种荧光染料的激发光讨论的波长范围）的波长的光激活时发射荧光 信号。此后，由荧光颗粒中的一个或多个产生的荧光信号可以在由检测系统检测到任何活 细胞的同时得以检测到。
[0022] 使用在此所述的染色方案，可能的是确定细胞样品（例如液体样品）的至少一部 分中的活细胞的数目。液体样品可以是例如水样