检测人血小板GSK-3β蛋白活性的斑点印迹方法

检测人血小板GSK-3β蛋白活性的斑点印迹方法
【技术领域】
[0001]发明属于生物医药技术领域，具体涉及能检测人血小板GSK-3 β蛋白活性的斑点印迹方法。
【背景技术】
[0002]糖原合酶激酶3 (Glycogen Synthase Kinase 3，GSK-3)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于哺乳动物真核细胞中。GSK-3是胰岛素依赖性糖原合成的重要调节因子，还能作用于众多信号蛋白结构蛋白和转录因子，调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡。
[0003]GSK-3主要有两种亚型，即GSK-3 α和GSK-3 β，分子量分别为5IkDa和47kDa，二者在催化区域具有98%的同源性，于N-和C-末端略有不同。尽管GSK-3的两个亚型都参与了神经精神失调，大多数研宄集中于其β亚型。GSK-30磷酸化是研宄最多的调节方式。GSK-3 0的正调节因子是第216位酪氨酸残基，该位点的磷酸化是GSK-3 0活性的基础，该残基高度磷酸化导致GSK-3 0在静止细胞的激活。GSK-3 0的负调节因子是第9位苏氨酸，该位点磷酸化可导致GSK-3 0失活。GSK-30在脑组织高表达，广泛分布，尤其在海马区域，参与突触可塑性、神经极性、神经炎症和神经稳态调控。临床研宄证明，GSK-3 β参与阿尔茨海默病等神经退行性疾病、精神分裂症、双向情感障碍等多种神经系统疾病的进程。
[0004]动物实验也证实，脑GSK-3 β的过度活化与tau蛋白过度磷酸化以及动物的空间记忆损伤呈显著正相关。但对人外周血液中GSK-3 0蛋白的活性缺乏理想监测方法。因此，研宄对患者血小板中GSK-30蛋白及酶活表达的检测方法，可望为临床疾病早期筛选、诊断提供科学依据。

【发明内容】

[0005]本发明的任务是提供一种能检测人血小板GSK-3 β蛋白活性的斑点印迹(Dot-blot)方法。所述的Dot-blot方法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。所述的方法依据抗原、抗体结合反应原理，可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。
[0006]实现本发明的具体方案是:
[0007]本发明提供的检测人血小板糖原合酶激酶3 β蛋白活性的方法，包括以下步骤:
[0008](I)血小板分离与纯化:人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血楽，中层是白细胞，下层是红细胞；取上层成分血楽，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板；血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于_80°C冰箱；
[0009](2)血小板蛋白提取与浓度测定:血小板加入预冷的裂解液120 μ I 2XBuffer,所述的 2XBuffer 由 50mM Tris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl.0.1 % SDS.0.02 %NaNR3R、20%甘油、cocktail、I % PMSF组成，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮1min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；
[0010](3)血小板蛋白斑点印迹测定:血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上，将NC膜晾干Ι-a后，置于含5%脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min，取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入对应的一抗，所述的对应的一抗为含 I % BSA 的 TBS 稀释的 1:1000GSK-3 β 和 Ser9_GSK_3 β，4°C过夜。I X TBST 缓冲液洗NC 膜 3 次，每次 5min，所述的 I XTBST 含 10mM NaCl、50mM Tris,0.5% Tween 20,pH 7.4，接着用双蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司标记IRDyeT 800通道的荧光二抗染料，所述的二抗用含I % BSA的TBS稀释为1:10000的抗体。室温下封膜孵育lh，I X TBST缓冲液洗膜3次，每次1min ;双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描、显色，分别测出GSK-3I3和Ser9_GSK_3 β的灰度值，得到反映GSK-3 β活性的Ser9-GSK-3 β /GSK-3 β比值。
[0011]本发明的特点是:建立的血小板GSK-30蛋白活性的检测方法，操作简单，准确快捷，并可同时检测多个样品，用于半定量分析。所构建的Dot-blot方法检测了血小板GSK-3 0蛋白及活性位点的表达，与Western Blot结果基本一致，说明建立的血小板GSK-3 β蛋白活性测定是简便、快捷、实用的评估方法。
[0012]实验资料
[0013]实验名称:斑点印迹法检测的2型糖尿病(T2DM)组、T2DM并MCI患者血小板GSK-3 β活性比较
[0014]实验方法及步骤:
[0015]一、实验方法:①入选标准:年龄>50岁糖尿病患者；无明显影响认知测试的视力、听力障碍；无严重低血糖、糖尿病酮症昏迷、高渗性昏迷病史；无酒精依赖及精神活性物质滥用病史；无脑外伤，无心脑血管事件发生，包括脑梗塞、脑出血、ΤΙΑ、心肌梗塞等；无影响认知测试的其他严重躯体疾病，如癫痫、甲状腺机能减退症、低氧血症等；无精神病史；自愿参加本研宄，能配合检查，依从性好。②研宄分组:2型糖尿病无认知功能障碍T2DM组(T2DM)，2型糖尿病并轻度认知功能障碍MCI组(T2DM-MCI)。两组年龄、性别、糖尿病病程、合并高血压比例、合并高脂血症比例、合并冠心病比例、并发症比例(糖尿病周围神经病变、糖尿病血管病变、视网膜病变等)、应用胰岛素治疗比例均匹配。③研宄指标:简易智力状态检查量表(MMSE) ,Western Blot,Dot Blot 检测血小板 GSK-3 β (Total) ,GSK-3 β (S9)活性。
[0016]二、实验步骤:
[0017]①血小板分离与纯化。人全血5ml，60g离心力，4摄氏度离心15min，上层是血浆，中层是白细胞，下层是红细胞。取上层成分血楽，60g离心力，4摄氏度离心15min，去沉淀，1500g离心15min，分为2层，上层为血清，下层为血小板。血小板标本用改良台氏液洗涤，1500g离心5min3次，储存于-80°C冰箱；
[0018]②血小板蛋白提取与浓度测定。血小板加入预冷的裂解液120 μ I 2XBuffer,所述的 2XBuffer 为 50mM Tris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl.0.1 % SDS.0.02 %NaNR3R、20%甘油、cocktail、l% PMSF，在冰上静置20min后，将蛋白样品置于沸水中煮1min使其蛋白充分变性，60hz超声15秒，BCA法测定蛋白浓度；
[0019]③血小板蛋白Dot-blot测定。血小板样品配置成统一浓度为5ug/ul，将2ul样品点于硝酸纤维素膜NC膜上。NC膜晾干l_2h后，置于含5%脱脂奶粉的封闭液中，摇床上室温封闭30-60min。取出NC膜，用双蒸水冲洗干净，加入1:1000的GSK-3 β和Ser9_GSK_3 β一抗，4°C过夜。I XTBST缓冲液洗NC膜3X5min，接着用双蒸水清洗掉泡沫。用Licor公司标记IRDyeT 800通道的1:10000荧光二抗染料室温下封膜孵育lh。I XTBST缓冲液洗膜3次，每次lOmin，同样用双蒸水冲洗泡沫，荧光扫描。
[0020] 三、实验结果:
[0021 ] ⑴T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3 β活性
[0022]血小板Dot Blot结果显示，糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者血小板GSK-3 β (ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，但二者GSK-3I3总蛋白表达无明显差异，见图1。
[0023](2)血小板 GSK-3 β 的 Dot Blot 与 Western Blot 比较
[0024]血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-313 (ser9)较单纯T2DM患者表达下降，活性增高，二者比较有统计学意义。但二组GSK-30总蛋白表达无统计学差异，见图2。
[0025](3)不同患者血小板Dot Blot与Western Blot比较
[0026]不同患者血小板Western Blot与Dot Blot结果基本一致，见图3。
[0027]四、实验结论:糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者较单纯T2DM患者血小板GSK-3 β活性增高。斑点印迹Ser9-GSK-3 β /GSK-3 β的比值可以较好反映GSK-3 β蛋白活性，可用于对GSK-3 β蛋白活性进行简单快速的定量分析。
【附图说明】
[0028]图1是Dot-blot检测T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3 β活性图，图中显示糖尿病合并轻度认知障碍T2DM-MCI患者血小板GSK-313 (ser9) /GSK-3 β比值较单纯T2DM患者下降，活性增高，说明斑点印迹可以检测GSK-30蛋白的相对活性。
[0029]图2是免疫印迹检测T2DM和T2DM-MCI组血小板GSK-3 β活性图，糖尿病合并轻度认知障碍(T2DM-MCI)组GSK-3 0 (ser9) /GSK-3 β比值较单纯T2DM患者