膜蛋白cd81在子痫前期预测、分型及诊疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于妇产科学高危妊娠领域，涉及膜蛋白CD81在子痫前期预测、分型及诊 疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 子痫前期（preeclampsia，PE)是妊娠期特有的并发症，以妊娠20周后出现的高血 压和蛋白尿为主要临床特征。能引起孕妇多器官功能损害，及胎儿宫内缺氧、胎儿生长受 限、医源性早产等，是导致孕产妇及围产儿病死率增高的重要原因。PE的病因不明，从发病 时间与孕周的关系看，目前分为早发型和迟发型，说明其病因具有异质性，而至今尚无更精 确的分型方法，这严重影响了 PE预测、预防与针对性治疗方法的建立。目前PE的治疗主要 是对症处理，无效时终止妊娠，但这将增加医源性早产。因此，亟待寻找有效的预测、分型及 防治方法。
[0003] ⑶81，又名抗增生抗体靶抗原-1 (TAPA-1)，是四次跨膜蛋白（TM4SF)超家族成员， 表达于哺乳动物的多种有核细胞。CD81分子四次跨越细胞膜，形成胞外区、跨膜区和胞内 区，在细胞外形成大小两个环状结构（EC1和EC2)。CD81在细胞内和跨细胞膜区域的成分 高度保守，而其大的细胞外环区域（EC2)具有易变性。胞外的较小和较大的环状结构区域， 是细胞膜上CD81感知细胞外信号的关键部位。对CD81结构特点进行分析，在其N末端发 现了一个潜在的豆蔻酯酰化位点，对CD81的功能调节存在重要作用。细胞膜上的CD81分 子并不孤立存在，而是与其它的TM4SF蛋白如CD9,或其它类型的跨膜蛋白分子结合，形成 不同的蛋白复合物，传递细胞外的信号，从而参与细胞生物学过程的调节。与CD81分子结 合的蛋白质有 CD4、CD8、CD9、CD21、CD82、HLA-DR 和整合素分子 a301、a401 和 a601 等。研宄表明CD81在机体的固有免疫及获得性免疫的激活和丙型肝炎病毒（HCV)感染过 程均有重要作用。但尚未见CD81与PE有关的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述空白，提供膜蛋白CD81在子痫前期预测、分 型及诊疗中的应用。
[0005] 本发明的另一目的是提供子痫前期预测、分型的试剂盒。
[0006] 本发明的又一目的是提供一种防治子痫前期的药物。
[0007] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0008] 膜蛋白CD81作为检测靶标在制备预测子痫前期的试剂盒中的应用。
[0009] 所述的试剂盒中含有检测膜蛋白CD81表达量的试剂；通过所述的试剂盒检测孕 妇妊娠前或妊娠初期以及妊娠过程中膜蛋白CD81的表达量，如果妊娠过程中膜蛋白CD81 的表达显著高于妊娠前或妊娠初期，则预测孕妇患有子痫前期。
[0010] 膜蛋白CD81作为检测靶标在制备子痫前期分型试剂盒中的应用。
[0011] 膜蛋白⑶81在早发型重度PE患者（孕周〈34周）中表达显著增高，早发型重度 PE患者病情发展迅速且容易并发胎儿窘迫及胎儿生长受限等。通过所述的检测试剂盒检测 膜蛋白CD81的表达量，能够区分PE为早发型还是迟发型，同时区分轻度还是重度；为临床 治疗选择不同方法提供依据和参考。
[0012] 膜蛋白CD81分子的拮抗物质在制备防治子痫前期的药物中的应用。
[0013] 所述的膜蛋白CD81分子的拮抗物质可以为中和抗体、siRNA及与CD81具有稳定 结合的分子（如四次跨膜蛋白同家族成员CD9)。
[0014] 一种用于预测子痫前期的检测试剂盒，包括用于检测膜蛋白⑶81表达量的试剂。
[0015] 其中，所述的检测膜蛋白⑶81表达量的试剂优选Western blotting检测膜蛋白 ⑶81表达量的试剂、免疫组织化学及组织免疫荧光检测膜蛋白⑶81表达量的试剂或者酶 联免疫检测膜蛋白CD81表达量的试剂。
[0016] 所述的Western blotting检测膜蛋白CD81表达量的试剂包括CD81鼠单克隆抗 体，所述单抗可按照现有技术公开的方法自制，也可购买商业化的产品，如Santa Cruz公司 生产的⑶81鼠单克隆抗体。
[0017] 所述的免疫组织化学及组织免疫荧光检测膜蛋白⑶81表达量的试剂包括⑶81 兔单克隆抗体，所述单抗可按照现有技术公开的方法自制，也可购买商业化的产品，如 Epitomics公司生产的⑶81兔单克隆抗体。
[0018] 所述的酶联免疫检测膜蛋白⑶81表达量的试剂优选使用双抗体夹心ELISA法检 测膜蛋白CD81的试剂。
[0019] 一种用于子痫前期分型的试剂盒，包括用于检测膜蛋白⑶81表达量的试剂。
[0020] 其中，所述的检测膜蛋白⑶81表达量的试剂包括Western blotting检测膜蛋白 ⑶81表达量的试剂、免疫组织化学及组织免疫荧光检测膜蛋白⑶81表达量的试剂或者酶 联免疫检测膜蛋白CD81表达量的试剂。
[0021] 一种用于防治子痫前期的药物，包括膜蛋白CD81分子的拮抗物质以及药学上允 许的辅料。所述的膜蛋白CD81分子的拮抗物质选自中和抗体、siRNA或者与CD81具有稳 定结合的分子（如四次跨膜蛋白同家族成员CD9)。
[0022] 有益效果：
[0023] 本发明从临床调查、体外检测CD81分子水平及整体动物实验，系统探讨CD81高表 达引起PE发病及其分子机制。临床调查研宄表明，与相同孕龄的正常孕妇相比，早发型重 度PE患者的胎盘中⑶81的表达显著升高。同时，对胎盘组织的切片进行⑶81及CK (滋养 细胞的标记分子）免疫组化染色，发现PE患者胎盘组织的⑶81染色明显深于正常孕妇的 胎盘切片，且CD81高表达部位主要在细胞滋养细胞。进一步，提取原代胎盘细胞滋养细胞 (cytotrophoblasts，CTBs)发现其高表达CD81，而CD81能抑制CTBs的侵袭。最后，我们将 CD81腺病毒经尾静脉注射妊娠大鼠，成功诱导大鼠PE的高血压表型。说明CD81可能是PE 发病的关键分子。基于上述研宄成果，提出膜蛋白CD81作为检测靶标可用于制备预测子痫 前期的试剂盒、子痫前期分型试剂盒以及膜蛋白CD81拮抗物质可用于制备防治子痫前期 的药物。
【附图说明】
[0024] 图1、组织免疫荧光检测胎盘绒毛中⑶81的表达
[0025] 其中，亮灰色表示有⑶81表达。A, B，C图显示在游离绒毛的内侧为细胞滋养细 胞，外侧为合体滋养细胞，不同孕周的游离绒毛的外侧合体滋养细胞未有亮灰色，而内侧细 胞滋养细胞上的亮灰色随孕周的增加而变少。D，E，F图显示固定绒毛的近端及远端的滋养 细胞的亮灰色随孕周的增加而减少。
[0026] 图2、Western blotting检测PE患者胎盘中⑶81表达
[0027] 其中，nPTL表示正常妊娠妇女组，sPE表示早发型重度PE患者组。
[0028] 图3、免疫组化检测PE患者胎盘组织切片中⑶81 (图A)与CK(图B)表达
[0029] 图4、Western blotting检测PE患者血清中CD81表达
[0030] 图5、胎盘原代CTBs的提取及培养
[0031] 图6、Transwell检测CD81对CTBs侵袭能力的作用
[0032] 图7、Western blotting检测大鼠胎盘中⑶81表达情况
[0033] 图8、免疫组化检测大鼠胎盘中⑶81表达情况
[0034] 其中箭头表示单个的大滋养细胞。
[0035] 图9、免疫组化检测子宫螺旋动脉⑶81和CK的表达
【具体实施方式】
[0036] 实施例1 :⑶81在早发型重度PE患者胎盘及血清中表达
[0037] 1、材料，试剂，设备
[0038] 1. 1人胎盘组织及血清来源
[0039] 选择2011年10月至2014年10月间在南京大学医学院附属鼓楼医院择期剖宫产 分娩的单胎初产妇，签署知情同意书，排除慢性高血压、孕前糖尿病、肾病、胎膜早破、感染 性疾病以及其它妊娠合并症和并发症。重度PE的诊断标准根据Williams产科学第23版。 在孕妇刚入院抽取静脉血，离心后血清保留_80°C冰箱。胎盘娩出后lOmin内采集胎盘母面 正中（避开钙化区及出血点）大小约1.0復\1.0復\1.0(^的组织数块，包括胎盘全层，从 底蜕膜板到绒毛板，不含羊膜层。用DEPC水处理过的PBS反复漂洗干净，干纱布吸除水分， 装入EP管后迅速经液氮速冻后置于-80°C冰箱备用。同时记录产妇年龄、身高、孕前体重、 孕龄、发病以来最高血压及最多的蛋白尿、血谷丙转氨酶、尿素氮，以及新生儿性别、出生体 重等。选择同期孕龄相匹配的正常妊娠妇女为对照组（表1)。
[0040]表1
[0041]
【主权项】
1. 膜蛋白CD81作为检测靶标在制备预测子痫前期的试剂盒中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的试剂盒中含有检测膜蛋白CD81表达 量的试剂；通过所述的试剂盒检测孕妇妊娠前或妊娠初期以及妊娠过程中膜蛋白CD81的 表达量，如果妊娠过程中膜蛋白CD81的表达显著高于妊娠前或妊娠初期，则预测孕妇患有 子痫前期。
3. 膜蛋白CD81作为检测靶标在制备子痫前期分型试剂盒中的应用。
4. 膜蛋白CD81分子的拮抗物质在制备防治子痫前期的药物中的应用。
5. -种用于预测子痫前期的检测试剂盒，其特征在于包括用于检测膜蛋白CD81表达 量的试剂。
6. 根据权利要求5所述的用于预测子痫前期的检测试剂盒，其特征在于所述的检测膜 蛋白⑶81表达量的试剂选自Westernblot检测膜蛋白⑶81表达量的试剂、免疫组织化学 或组织免疫荧光检测膜蛋白CD81表达量的试剂，或者酶联免疫检测膜蛋白CD81表达量的 试剂。
7. -种用于子痫前期分型的试剂盒，其特征在于包括用于检测膜蛋白CD81表达量的 试剂。
8. 根据权利要求7所述的用于子痫前期分型的试剂盒，其特征在于所述的检测膜蛋白 ⑶81表达量的试剂包括Westernblot检测膜蛋白⑶81表达量的试剂、免疫组织化学或组 织免疫荧光检测膜蛋白CD81表达量的试剂，或者酶联免疫检测膜蛋白CD81表达量的试剂。
9. 一种用于防治子痫前期的药物，其特征在于包括膜蛋白CD81分子的拮抗物质以及 药学上允许的辅料。
10. 根据权利要求9所述的药物，其特征在于所述的膜蛋白CD81分子的拮抗物质选自 中和抗体、siRNA或者与CD81具有稳定结合的分子；所述的与CD81具有稳定结合的分子优 选四次跨膜蛋白同家族成员CD9。
【专利摘要】本发明公开了膜蛋白CD81在子痫前期预测、分型及诊疗中的应用。发明人通过临床调查、体外分子实验及动物实验发现，CD81通过抑制滋养细胞的侵袭能力导致子宫螺旋动脉的重塑障碍，从而引起PE发病。故CD81可作为预测PE的标记分子并可能成为PE分型的标记分子，且有可能成为防治PE的靶点。
【IPC分类】A61K48-00, A61P15-00, G01N33-68, A61K39-39, G01N33-577
【公开号】CN104698187
【申请号】CN201510095649
【发明人】胡娅莉, 周艳, 刁振宇, 沈莉, 颜桂军, 赵光峰
【申请人】南京鼓楼医院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月3日