一种利用生物元件检测痕量二价铜离子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用生物材料进行环境检测领域，具体地说是一种利用生物元件检测 痕量二价铜离子的方法。
【背景技术】
[0002] 铜是生物体必需的微量元素，缺乏或过多都将产生不良影响。对人体来说，过量的 铜会引起肝硬化、皮肤病以及神经紊乱等问题。对低等动物比如水生生物的毒性就更为严 重，会阻滞水体的自净过程，使蓝藻及其它一些水生微生物不能顺利生长发育。随着工农业 生产的快速发展，水体铜污染日趋严重。"三废"的排放、含铜矿产的开采、、含铜杀菌剂的长 期大量使用和城市污泥的堆肥利用，使水体含铜量达到未污染水体的几倍甚至几十倍，远 远超出了水体环境接纳铜的能力，威胁到生态系统的稳定和人类的安全。因此，污染水体的 中的二价铜离子也逐渐引起人们的重视。目前检测二价铜离子的方法主要有原子吸收法， 比色法，荧光猝灭法，极谱仪法，电化学发光分析法，电修饰法。但是以上方法有的需要大型 仪器，有的需要专业人员，有的检出限较高，有的反应试剂获取困难。而本方法的二价铜离 子指示试剂为生物元件，可以直接从生物体中大量产生，并且纯化步骤简单，容易获取、此 外该方法可以在室温条件下快速进行，可以结合紫外灯实现污染水体中二价铜离子的快速 检测。具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种利用生物元件检测痕量二价铜离子的方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] -种利用生物元件检测痕量二价铜离子的方法，取缓冲液与荧光铁载体溶液P在 水环境下于室温下反应5-10min，所得反应液A，待用；再取缓冲液与荧光铁载体溶液P在 待测样品的环境下于室温下反应5-10min，所得反应液B，待用；收集420nm-600nm波长范 围内反应液A与反应液B的不同发射光谱，通过光谱计算出荧光猝灭率a，并将其依据标准 曲线计算样品中二价铜离子的浓度；所述缓冲液为l_8〇mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液， pH7-8〇
[0006] 所述缓冲液为度为l-80mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，pH7-8。
[0007] 所述荧光铁载体溶液P获取的具体步骤为：挑取铜绿假单胞菌的单菌落培养在培 养基YK中，于30°C下培养12h后，将菌液置于10mL离心管中离心吸取上清液；上清液为荧 光铁载体粗产品，粗品经固相洗脱铜柱纯化，获得具有410nm荧光激发波长的荧光铁载体 溶液P。
[0008] 将试剂B与荧光铁载体粗产品混匀后在固相洗脱铜柱上静置5-10分钟后，经去离 子水冲洗去除试剂B，荧光铁载体粗产品固定在吸附柱上，然后加入试剂C将荧光铁载体洗 脱下来，收集洗脱液，纯化的具有410nm荧光激发波长的荧光铁载体溶液P。
[0009] 所述洗脱液为 0? 02MNa2HP04,0. 5MNaCl，0. 05MEDTA，pH7. 2 ;试剂B为：0? 02M Na2HP04,1MNaCl,pH7. 2 ;试剂C为：0? 02MNa2HP04,1MNH4C1，pH7. 2。
[0010] 所述培养基YK成分为 6-10gK2HP04,3-5gKH2P04，l-3g(NH4)S04,0.l-0.4gMgS04， 4_5g琥珀酸，去离子水定容到1L，调PH7.0,高温高压灭菌。
[0011] 标准曲线的获取：
[0012] (1)二价铜离子母液的配制：将2. 497gCu2S04 ? 5H20在100ml容量瓶中用去离子 水定容。获得〇. 1M母液。
[0013] (2)构建缓冲条件：将不同浓度梯度的的二价铜离子溶液与100y1D液混合，并 用去离子水将溶液总体积补足到980y1，充分混匀，最终二价铜离子的浓度为0yM, 0. 1y M，0? 2uM，0? 4uM，0? 6uM，0? 8uM，1uM，2uM，4uM，6uM，8uM，10uM，20uM，30uM，40u M，50uM，100uM。
[0014] (3)与荧光铁载体温浴：将步骤⑵获得一系列的缓冲体系中分别加入20y1荧 光铁载体溶液P并在室温下反应5min。
[0015] (4)荧光仪测定：将步骤（3)所得不同液体用荧光仪进行测定，激发光为410nm， 收集420nm-600nm波长范围内的发生光谱，并记录460nm处的发射光强度。然后计算出焚 光猝灭率a(a= 1-1/%)。其中I为在不同浓度的二价铜离子条件下于460nm处的获得 的发射光强度，1〇为在〇UM二价铜离子条件下于460nm处获得的的发射光强度。以荧光猝 灭率a依据标准曲线计算样品中二价铜离子的浓度。
[0016] (5)标准曲线的绘制：用origin对数据进行处理绘图，获得标准曲线。
[0017] 与现有技术相比，本发明的积极效果是：
[0018] 目前，测定痕量二价铜离子以ICP/MS为主，仪器昂贵，操作复杂，且需要专业人 员。现有的检测二价铜离子化学检测方法，一般来说反应试剂获取步骤复杂，该反应的反 应试剂为生物材料，可以从生物中直接产生。因此步骤简单，费用低廉。此外，本发明利用 二价铜离子与荧光铁载体的配位反应对二价铜离子进行检测，其可以在室温条件下快速进 行，可以结合紫外灯实现污染水体中二价铜离子的快速检测。具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例提供的所用的荧光铁载体的结构式。
[0020] 图2为本发明实施例提供的荧光铁载体的提纯步骤图。
[0021] 图3为本发明实施例提供的利用荧光铁载体对二价铜离子检测的效果图，图中二 价铜离子的浓度分别为OnM, 10nM, 100nM，1yM, 10yM, 100yM。
[0022] 图4为本发明实施例提供的浓度梯度二价铜离子溶液用该方法测定后获得的标 准曲线。
[0023]图5为在其他水溶离子的干扰下对铜离子进行检测的特异性图。其中铜离子的浓 度为10yM,其他金属离子的浓度为100yM。
[0024] 图6为本发明实施例提供的采用本发明方法检测铜离子的流程图示。
[0025] 具体实例方式
[0026] 本发明以细菌分泌的荧光铁载体为反应材料。二价铜离子的存在可以猝灭荧光铁 载体的荧光从而完成检测。并通过本发明可以检测到实际样品中加标的二价铜离子。
[0027] 实施例1:自来水中二价铜离子的加标浓度测定。
[0028] (1)样品的获取：自来水取自烟台市莱山区自来水系统。
[0029] (2)自来水的加标处理：将二价铜离子加入自来水至终浓度为0.5y M。
[0030] (3)将加标处理的自来水865y1与100y1D液充分混匀
[0031] (4)与荧光铁载体温浴：将步骤（3)所得液与溶液P在室温下温浴5min，获得液体 F〇
[0032] (5)将去离子水880y1与100y1D液充分混勾，并与溶液P在室温下温浴5min， 获得反应液E。
[0033] (6)二价铜离子浓度的计算：将步骤⑷与步骤（5)最终所得液体E，F用荧光仪 进行测定，激发光为410nm,收集420nm-600nm波长范围内的发生光谱，并记录460nm处的 发射光强度。然后计算出荧光猝灭率a(a= 1-1/%)。其中I为液体E在460nm处的发 射光强度，1〇为液体F在460nm处的发射光强度。以荧光猝灭率a依据标准曲线计算样品 中二价铜离子的浓度（参见表1)。
[0034] (7)将以上步骤反复三次。
[0035] (8)最终该反法的测试结果为：5. 14±0. 27yM。
[0036] (9)用ICP/MS的方法对自来水中的二价铜离子进行检测，结果为： 4. 92±0. 21yM。
[0037] 所述D液的配方为：浓度为10mM的HEPES缓冲液，pH7. 4。
[0038] 参见图2所述荧光铁载体溶液P获取的具体步骤为：挑取铜绿假单胞菌的单菌落 培养在培养基YK中，于30°C下培养12h后，将菌液置于10mL离心管中离心吸取上清液； 上清液为荧光铁载体粗产品，将试剂B与荧光铁载体粗产品混匀后在固相洗脱铜柱上静置 5-10分钟后，经去离子水冲洗去除试剂B，荧光铁载体粗产品固定在吸附柱上，然后加入试 剂C将荧光铁载体洗脱下来，收集洗脱液，便为纯化的荧光铁载体（参见图1)。
[0039]同时，荧光铁载体溶液P的获得可具体可参见文献Yinetal.，2015.
[0040]Biosens.Bioelectron. 64, 81~87〇
[0041] 所述洗脱液为 0? 02MNa2HP04,0. 5MNaCl，0. 05MEDTA，pH7. 2 ;试剂B为：0? 02M Na2HP04,1MNaCl,pH7. 2 ;试剂C为：0? 02MNa2HP04,1MNH4C1，pH7. 2。
[0042] 所述培养基YK成分为 6gK2HP04, 3gKH2P04,lg(NH4)S04,0?lgMgS04,4g琥珀酸，去 离子水定容到1L，调PH7. 0,高温高压灭菌。
[0043] 标准曲线的获取：
[0044] (1)二价铜离子母液的配制：将2. 497gCu2S04?5H20在100ml容量瓶中用去离子 水定容。获得〇. 1M母液。
[0045] (2)构建缓冲条件：将不同浓度梯度的的二价铜离子溶液与100U1D液混合，并 用去