一种制备血吸虫尾蚴稀土上转换荧光标记物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种引入稀土上转换纳米颗粒而实现血吸虫尾呦荧光靶向成像的方法。
【背景技术】
[0002]血吸虫病是最严重和最被忽视的热带疾病之一。世界卫生组织认为血吸虫病是除疟疾外对社会经济破坏最严重的热带疾病。世界范围内新增血吸虫病感染人数从2006年的1240万增长到2012年的3500万。迄今为止，已经发现的人体血吸虫病主要有6种:埃及血吸虫病、日本血吸虫病、曼氏血吸虫病、间插血吸虫病、马来血吸虫病和湄公血吸虫病，其广泛分布于亚洲、非洲及拉丁美洲的76个国家和地区；我国流行的只是日本血吸虫，日本血吸虫病分布于长江流域的湖南、湖北、江西、安徽、江苏、浙江、四川、云南、广东、广西、福建和上海等12个省、市、自治区。目前，重点流行区主要集中在长江中下游沿江5省和四川、云南等7省。
[0003]在血吸虫生命周期中，尾呦阶段是其唯一感染人的阶段，尾呦阶段也是血吸虫的生命周期中最脆弱的阶段，通过杀灭尾呦可以有效抑制血吸虫病的传播。以水面的血吸虫尾呦作为监测对象，是对血吸虫尾呦实时监控的重点。要对血吸虫尾呦进行特异性分辨，关键在于检测传感器，所以研制可以对血吸虫尾呦进行具有高灵敏性识别的传感器，是建立血吸虫自动检测和监控系统的关键。由于许多尾呦本身可供分析的信号较弱，要获得高灵敏度的检测，需借助外来的标记物获得可测量的信号。生物标记是现代化学和生命科学研宄的热点之一，目前生物标记的常见探测机制有光、电、热、声和磁五种，其中以光信号作为探测机制的被称为发光标记。
[0004]稀土发光纳米材料因其独特的光学性质而在生物信息领域中展示了它的广阔应用前景；以稀土发光材料为荧光标记物的研宄正在成为生命科学研宄领域的热点和前沿。生物体内大量存在的内源性荧光物质在生物荧光标记和成像过程中会对荧光信号产生非常严重的干扰，从而降低探针信号的信噪比。如何消除背景荧光的干扰是生物荧光检测技术中亟需解决的重要问题之一。目前广泛应用的有机染料和半导体量子点等荧光标记物的激发光源均为紫外光或蓝紫光，与生物样品中内源性荧光物质的激发波段相同，因此在生物荧光标记和成像过程中会产生大量的背景噪音。
[0005]而稀土掺杂的上转换发光纳米材料可以将低频光子转化为高频光子。通过对材料中敏化剂离子和发光中心离子进行调控，可以实现将位于生物组织的光透过窗口(800-1200 nm)的近红外光(波长一般为980 nm)转化为可见光或高频近红外光。由于生物组织对这一波段的近红外光吸收非常弱，因此可以避免自发荧光的产生，从而获得较高的荧光信号信噪比。稀土掺杂的上转换纳米发光材料的这些独特光学性质使其有望成为一种极具发展前景的新型生物发光标记材料。
[0006]综上所述，亟需寻找一种可以有效地消除背景荧光干扰的荧光标记方法。
【发明内容】
[0007]( I)要解决的技术问题
本发明为了克服现有血吸虫尾呦荧光标记和成像过程中会产生大量的背景噪音的缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种可以有效地消除背景荧光干扰的制备血吸虫尾呦稀土上转换荧光标记物的方法。
[0008](2)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了这样一种制备血吸虫尾呦稀土上转换荧光标记物的方法，包括以下工序:
1)将稀土硝酸盐与油酸反应，获得稀土上转换荧光纳米颗粒UCs-OA;
2)将纳米颗粒UCs-OA与间氯苯甲酸反应，获得环氧化稀土上转换荧光纳米颗粒UCs-EOA ；
3)将纳米颗粒UCs-EOA与PEG氯硝柳胺反应，获得载药稀土上转换荧光纳米颗粒UCs-Ni ；
4)利用原子力显微镜和透射电子显微镜测试纳米颗粒UCs-Ni的表面微观结构；
5)利用荧光光谱仪测试纳米颗粒UCs-Ni的荧光发射光谱；
6)利用共聚焦荧光显微镜测试纳米颗粒UCs-Ni的KB细胞荧光成像；
7)利用共聚焦荧光显微镜测试纳米颗粒UCs-Ni的血吸虫尾呦荧光成像。
[0009]优选地，在所述工序I)中，所述纳米颗粒UCs-OA的制备方法包括如下步骤:
a)将NaOH，水，乙醇，油酸在搅拌下进行混合，形成均匀的溶液；
b)将稀土硝酸盐水溶液、NH4F水溶液依次慢慢滴加到步骤a)得到的溶液中，并拌8-11分钟，得到混合物；
c)将步骤b)得到的混合液转移至高压反应釜，将该体系在155°-167°维持7.5小时并冷却至室温，得到混合物；
d)将环己烷加入步骤c)得到的混合物，得到混合液；
e)将乙醇加入步骤d)得到的混合物并离心，得到粉末状样品；
f)用乙醇和水依次洗涤步骤e)得到的粉末状样品，并离心得到纳米颗粒UCs-OA; 在所述工序2)中，所述纳米颗粒UCs-EOA的制备方法包括如下步骤:
a)将所述纳米颗粒UCs-OA、环己烷、CH2Cl2、间氯苯甲酸充分混合并加热回流3_4小时；
b)将步骤a)得到的溶液冷却至室温，得到纳米颗粒UCs-EOA;
在所述工序3)中，所述纳米颗粒UCs-Ni的制备方法包括如下步骤:
a)将PEG氯硝柳胺加入所述纳米颗粒UCs-EOA，在室温下搅拌6_8小时得到混合液；
b)将步骤a)得到的混合液离心，得到粉末状样品；
c)用乙醇和水依次将将步骤b)得到的粉末状样品洗涤三次，得到产物纳米颗粒UCs-Ni ；
在所述工序4)中，所述纳米颗粒UCs-Ni的表面微观结构测试方法包括如下步骤:
a)将所述纳米颗粒UCs-Ni制成100μ g / mL溶液；
b)将10μ I a)中所述的纳米颗粒UCs-Ni溶液滴加在以铁片为基底的新剥离云母片上，自然晾干，得到样品；
c)将b)中所述的样品在原子力显微镜中进行测试； d)将10μ I a)中所述的纳米颗粒UCs-Ni溶液滴加在铜网格上，自然晾干，得到样品；
e)将d)中所述的样品在透射电子显微镜中进行测试；
在所述工序5)中，纳米颗粒UCs-Ni的荧光发射光谱测试方法包括如下步骤:
O将纳米颗粒UCs-Ni制成100 μ g / mL溶液；
ii)将i)中纳米颗粒UCs-Ni溶液放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试，通过测试反映纳米颗粒UCs-Ni在激发光下荧光发射强度，所述荧光光谱仪为Edinburgh LFS920 ;所述石英池子长度为I cm;测量条件为:试时激发光波长为400 nm，使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为I nm，狭缝宽度为2.5 nm，光散射的强度值为测试15s中强度的平均值，整体测试使用衰减模式；
在所述工序6)中，所述共聚焦荧光显微镜测试纳米颗粒UCs-Ni的KB细胞荧光成像方法包括如下步骤:
a)将所述纳米颗粒UCs-Ni 制成 100 μ g / mL (DMSO/PBS，v/v=l:399)溶液；
b)将KB细胞用a)中所述的含100yg / mL纳米颗粒UCs-Ni的培养基溶液在3 %CO2,97 %空气，温度为36° C的环境下孵育10 min，利用共聚焦荧光显微镜测试KB细胞样品的荧光成像，通过KB细胞的荧光成像来判断化合物N1-3的生物相容性、细胞穿透性；
在所述工序7)中，所述共聚焦荧光显微镜测试纳米颗粒UCs-Ni的血吸虫尾呦荧光成像方法包括如下步骤:
i )将所述纳米颗粒 UCs-Ni 制成 100 μ g / mL (DMSO/PBS, v/v=l:399)溶液；ii)将活性的血吸虫尾呦移入i)中所述的含100 μ g / mL纳米颗粒UCs-Ni的培养基溶液中培养，利用共聚焦荧光显微镜测试血吸虫尾呦样品的荧光成像。
[0010]优选地，在所述工序4)的步骤c)中，所述原子力显微镜为Nanoscope IIIa型；所述测量条件为扫描模式为Tapping模式，扫描速度为10 Hz?扫描范围为I * I μπι;在所述工序4)的步骤e)中，所述透射电子显微镜为JEM- 2010F型；所述测量条件为扫描电压为 200 kVo
[0011]通过引入稀土上转换纳米颗粒使氯硝柳胺具有荧光性能，利用荧光光谱仪纳米颗粒UCs-Ni紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱，利用激光共聚焦显微镜测试纳米颗粒UCs-Ni的KB细胞荧光成像和血吸虫尾呦荧光成像，实现了通过引入稀土上转换纳米颗粒使氯硝柳胺在血吸虫尾呦体内荧光成像的方法。
[0012](3)有益效果
(a)本发明通过引入稀土上转换纳米颗粒，制备了具有荧光性能的氯硝柳胺载药纳米颗粒 UCs-Ni。
[0013](b)本发明利用荧光光谱仪测试纳米颗粒UCs-Ni荧光发射光谱，能够有效地确定纳米颗粒UCs-Ni的荧光性能。
[0014](C)本发明利用激光共聚焦显微镜测试纳米颗粒UCs-Ni的KB细胞荧光成像，结果表明UCs-Ni具有生物兼容性，适合作为生物标记物