。
[0015]Cd)本发明中UCs-Ni中含有对血吸虫尾呦具有特异性的氯硝柳胺药物，从而有效地实现了特异性的荧光标记。
[0016](e)本发明中UCs-Ni在波长为980 nm的光激发下，在630-670 nm处发射了较强荧光，由于生物组织对这一波段的近红外光吸收非常弱，因此可以避免自发荧光的干扰。
【附图说明】
[0017]图1是标记物的原子力显微镜图及透射电子显微镜图:a.UCs-Ni的AFM图；b.UCs-Ni 的 TEM 图 ο
[0018]图2是纳米颗粒UCs-Ni的荧光发射光谱(100 μ g/ml的012(:12溶液)。
[0019]图3是KB细胞荧光标记的共聚焦荧光(a)、明场(b)和叠加(C)图，细胞在含100 μ g/ml纳米颗粒UCs-Ni的培养基中36° C条件下孵育10分钟；(d)是通过线标记的细胞荧光强度侧面剖析图；共聚焦显微镜激发波长为980 nm，收集发射荧光630-670 nm的信号，标尺为:30 μπι。
[0020]图4是尾呦的共聚焦荧光、明场和叠加图；室温下尾呦在含有100 μ g/ml纳米颗粒UCs-Ni的PBS缓冲液荧光标记图，荧光染色时间分别为10 min (a)，30 min (b)和I h(c);共聚焦显微镜激发波长为980 nm收集发射荧光630-670 nm的信号。
图5是纳米颗粒UCs-OA结构示意图。
图6是纳米颗粒UCs-EOA结构示意图。
图?是纳米颗粒UCs-Ni结构示意图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
[0022]实施例1
1.制备以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒:
1)所使用物质的结构:2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基氯硝柳胺(PEG氯硝柳胺)、纳米颗粒UCs-OA、纳米颗粒UCs-EOA和纳米颗粒UCs-Ni的结构，如下所示:
2-[2-(2-轻基乙氧基)乙氧基]乙氧基氯硝柳胺(2-[2-(2_hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxyl niclosamide, PEG 氯硝柳胺)。
图5是纳米颗粒UCs-OA结构示意图，纳米颗粒UCs-OA的结构示意图见图5。
图6是纳米颗粒UCs-EOA结构示意图，纳米颗粒UCs-EOA的结构示意图见图6。
图7是纳米颗粒UCs-Ni结构示意图，纳米颗粒UCs-Ni的结构示意图见图7。
2)纳米颗粒UCs-OA:将 NaOH (1.2g，30mmol )，水(1ml )，乙醇(1ml )，油酸(20ml)在搅拌下进行混合，形成均勾的溶液。然后在磁力搅拌下滴加0.6mmol (total amounts)稀土硝酸盐水溶液(1.2 ml，0.5 mol/L)。随后，将4 ml NH4F水溶液(1.0 M)逐滴加入到上述溶液中。将混合物搅拌约10分钟，然后转移至50 ml高压反应釜，将该体系在155-167°C维持7.5小时。将该体系冷却至室温，产物沉积在容器底部。用环己烷溶解并收集产物。将乙醇加入含样品的环己烷的溶液，产物沉淀析出。将所得混合物离心，得到粉末状样品。最后，依次用乙醇和水将产物洗涤几次以除去油酸和油酸钠等杂质。得到产物稀土上转化纳米颗粒UCs-OA。
[0023]3)纳米颗粒UCs-EOA:将新制的100 mg UCs-OA样品分散于50 ml锥形瓶中，加入20 ml环己烷、10 mlCH2Cl2、25mg间氯苯甲酸，在搅拌下将混合物回流3_4小时；随后，将混合物冷却至室温，得到UCs-EOA。
[0024]4)纳米颗粒UCs-N1:将0.7 mmol PEG氯硝柳胺加入上述混合物，在室温下搅拌6-8小时。然后将所得混合物离心，得到粉末状样品。最后，用乙醇和水依次将产物洗涤三次，得到产物载药稀土上转化纳米颗粒UCs-Ni。
[0025]2.检测以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒的表面形貌。利用原子力显微镜及透射电子显微镜等技术对纳米颗粒结构进行了表征，如图1所示。原子力显微镜和透射电子显微镜的结果均表明UCs-Ni尺寸较均勾，粒径在15_20nm之间。
[0026]3.检测以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒荧光强度。将100 yg / mL纳米颗粒UCs-Ni溶液放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试，结果如图2所示。测量条件为测试时激发光波长为980nm。使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为I nm，狭缝宽度为2.5 nm。光散射的强度值为测试15 s中强度的平均值。整体测试使用衰减模式。通过测试结果表明纳米颗粒UCs-Ni在特定激发光下产生了两个荧光发射峰，特别是在630-670 nm之间存在一个发射峰。
[0027]4.检测以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒生物相容性和细胞穿透性。KB细胞用含100 yg / mL纳米颗粒UCs-Ni的培养基溶液在3 % CO2, 97 %空气，温度为36°C的环境下孵育10 min。利用共聚焦显微镜跟踪细胞体内的荧光变化，结果如图3所示。细胞实验结果表明UCs-Ni能够较好进入细胞体内，因此具有较好的生物兼容性，适合作为生物荧光标记物。
[0028]5.利用以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒进行血吸虫尾呦荧光成像，如图4所示。活性的血吸虫尾呦移入到200 μ L的100 μ g / mL的纳米颗粒UCs-Ni的PBS稀释液中，盖上器皿盖以防溶液挥发而造成浓度的改变，引起实验误差。然后利用共聚焦荧光显微镜在10 min,30 min和I h及时观察血吸虫尾呦染色情况，并采集荧光图像。共聚焦显微镜激发波长为980nm收集发射荧光640-670nm的信号，标尺为:20 ym。从图4中可以观察到，随着UCs-Ni与尾呦接触时间的增加，尾呦体内的荧光分布增广，强度增强。因此结果说明UCs-Ni对尾呦具有较好的荧光标记效果。
[0029]实施例2
1.制备以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒:
I)纳米颗粒 UCs-OA JfNaOH (1.8g，45mmol )，水(1ml )，乙醇(12ml )，油酸(26ml)在搅拌下进行混合，形成均勾的溶液。然后在磁力搅拌下滴加0.8mmol (total amounts)稀土硝酸盐水溶液(1.6 ml,0.5 mol/L)。随后，将3 ml NH4F水溶液(1.5 M)逐滴加入到上述溶液中。将混合物搅拌约10分钟，然后转移至100 ml高压反应釜，将该体系在155-167°C维持9小时。将该体系冷却至室温，产物沉积在容器底部。用环己烷溶解并收集产物。将乙醇加入含样品的环己烷的溶液，产物沉淀析出。将所得混合物离心，得到粉末状样品。最后，依次用乙醇和水将产物洗涤几次以除去油酸和油酸钠等杂质。得到产物稀土上转化纳米颗粒UCs-OA。
[0030]2)纳米颗粒UCs-EOA:将新制的130mg UCs-OA样品分散于50 ml锥形瓶中，加入25 ml环己烷、13 mlCH2Cl2、25mg间氯苯甲酸，在搅拌下将混合物回流3_4小时；随后，将混合物冷却至室温，得到UCs-EOA。
[0031]3)纳米颗粒UCs-N1:将0.6 mmol PEG氯硝柳胺加入上述混合物，在室温下搅拌
6-8小时。然后将所得混合物离心，得到粉末状样品。最后，用乙醇和水依次将产物洗涤三次，得到产物载药稀土上转化纳米颗粒UCs-Ni。
[0032]2.检测以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒的表面形貌:利用原子力显微镜及透射电子显微镜等技术对纳米颗粒结构进行了表征。
[0033]3.检测以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒荧光强度:将200 μ g / mL纳米颗粒UCs-Ni溶液放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试。测量条件为测试时激发光波长为980nm。使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为I nm，狭缝宽度为2.5 nm。光散射的强度值为测试15 s中强度的平均值。整体测试使用衰减模式。通过测试反映纳米颗粒UCs-Ni在特定激发光下荧光发射强度。
[0034]4.检测以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒生物相容性和细胞穿透性:KB细胞用含200 μ g / mL纳米颗粒UCs-Ni的培养基溶液在3 % CO2, 97 %空气，温度为36°C的环境下孵育10 min。转移至共聚焦显微镜下跟踪细胞体内的荧光变化。
[0035]5.利用以氯硝柳胺为母体的血吸虫尾呦稀土上转换荧光纳米颗粒进行血吸虫尾呦荧光成像:活性的血吸虫尾呦移入到200 μ L的100 Ug / mL的纳米颗粒UCs-Ni的PBS稀释液中，盖上器皿盖以防溶液挥发而造成浓度的改变，引起实验误差。然后用共聚焦荧光显微镜在10 min,30 min和I h及时观察血吸虫尾呦染色情况，并采集荧光图像。共聚焦显微镜激发波长为980nm收集发射荧光640_670nm的信号。
[0036]实施例3
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