正己烷预处理-高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中氯霉素残留量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种测定蜂蜡中氯霉素残留量的方法。
【背景技术】
[0002] 氯霉素（chloramphenicol,CA巧是一种高效广谱的抗生素，对各种好氧和厌氧微 生物都有活性，被广泛用于畜牧养殖业。但氯霉素对人类具有一定的毒性作用，如引起人的 粒细胞缺乏病，再生障碍性贫血和过敏等症状。FA0 /WA0规定食品中氯霉素的残留不得检 出，欧盟巧EC)96 / 23指令中把CAP列入禁用药，并规定氯霉素MRPUminimumrequired performancelimits)值为 0. 3yg/kg。
[0003] 我国是世界养蜂大国，也是蜂产品生产及出口大国，2013全年蜂蜡总产量约8000 吨。蜂蜡是一种由工蜂腹部下面四对蜡腺分泌的物质，其主要成分是烧醇和烧酸形成的醋 类等，在化妆品、食品和医药工业上应用广泛。然而，蜂农在养殖蜜蜂过程中喷洒氯霉素药 物用于预防和治疗蜜蜂疾病，造成蜂蜡中氯霉素残留。由于蜂蜡的循环使用导致蜂蜡中氯 霉素残留量不断增加，同时，通过蜜蜂与巢脾的接触，氯霉素药物残留能够转移至蜂蜜、蜂 王浆、蜂胶等蜂产品中，进而造成其他蜂产品污染。氯霉素在蜂蜡中的残留不仅关系到人 体身体健康，也将对我国蜂蜡出口贸易产生巨大的风险。
[0004] 近年来，国内外有较多蜂蜡中杀菌剂等农药残留检测方法的报道，但尚未有蜂蜡 中氯霉素残留量检测方法的报道。由于蜂蜡的基质复杂，无法采用国内外已公布的检测蜂 蜜、蜂王浆等蜂产品中氯霉素的方法进行检测。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种正己烧预处理-高效液相色 谱串联质谱法测定蜂蜡中氯霉素残留量的方法，该法简便、灵敏高、基质干扰小等优点，并 已用于蜂蜡样品中痕量氯霉素残留的定性和定量分析。
[0006] 为了实现上述的目的，本发明采用了W下的技术方案： 正己烧预处理-高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中氯霉素残留量的方法，该方法包 括W下的步骤： 1) 标准溶液的配制 称取氯霉素标准品10mg置于100mL栋色容量瓶中，精确至0. 1mg，用甲醇溶解并定 容至刻度，混匀配制成100mg/L的标准储备液；用甲醇配制成Img/L的单标储备液，根据实 际需要用流动性稀释成相应的混合标准工作溶液；氯霉素-D5作为同位素内标的浓度为10 ng/mL;各种标准溶液避光保存于4 °C冰箱中； 2) 蜂蜡预处理 试样可在70°C左右加热条件下溶解并混匀； 3) 提取 称取试样2.0g于50血盖离屯、管中，精确至0.01g，加入10血正己烧，祸旋超声溶 解后加10mL水祸旋振荡提取，8000r/min离屯、5min，取下层水层，待净化； 4) 净化 移取试样提取液于OASISHLB固相净化小柱中，OASISHLB固相净化小柱使用前依次用 3血甲醇，5血水活化，弃去流出液，先用5血超纯水淋洗，再用5血甲醇/水，甲醇/水 溶液的体积比为2/8,溶液淋洗小柱，弃去流出液，最后用5mL己酸己醋洗脱，收集洗脱液 于带刻度离屯、管中，氮吹浓缩至近干，最后用甲醇/水溶液定容至1 111以混匀后经0.22化 有机相滤膜过滤后用于上机分析； 5) 色谱条件 色谱柱；Ac州core化C18 柱，150mmX4. 6mm，4ym;柱温；35°C;进样量；10uL;流 速；0. 5血/min;流动相；A为水溶液，B为甲醇溶液；梯度洗脱程序；0~0. 5min，70%A; 0. 5 ~7. 0min, 70〇/〇A~10〇/〇A;7. 0 ~8. 0min, 10〇/〇A;8. 0 ~8. 1min, 10〇/〇A~70〇/〇A;8. 1 ~ 12. 0min，70〇/〇A; 6) 质谱条件 扫描方式：负模式扫描；检测方式：多反应监巧U(MRM);电喷雾电压（Spray voltage) ;-3000V;銷气（Sheathgaspressure) ;207kPa;辅助气（Auxiliarygas flow) ;10arbitraryunits;毛细管温度（CapillaryTemperature) ;350°C;蒸发温度 (VaporizerTemperature) ;300°C;碰撞气；氣气（1. 5mtorr); 氯霉素和内标的质谱条件参数：
【主权项】
1.正己烷预处理-高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中氯霉素残留量的方法，其特征 在于该方法包括以下的步骤： 1) 标准溶液的配制 称取氯霉素标准品10 mg置于100 mL棕色容量瓶中，精确至0.1 mg，用甲醇溶解并定 容至刻度，混匀配制成100 mg/L的标准储备液；用甲醇配制成lmg/L的单标储备液，根据实 际需要用流动性稀释成相应的混合标准工作溶液；氯霉素-D5作为同位素内标的浓度为10 ng/mL ;各种标准溶液避光保存于4 °C冰箱中； 2) 蜂蜡预处理 试样可在70°C左右加热条件下溶解并混匀； 3) 提取 称取试样2.0 g于50 mL盖离心管中，精确至0.01 g，加入10 mL正己烧，祸旋超声溶 解后加10 mL水祸旋振荡提取，8000 r/min离心5min，取下层水层，待净化； 4) 净化 移取试样提取液于OASIS HLB固相净化小柱中，OASIS HLB固相净化小柱使用前依次用 3 mL甲醇，5 mL水活化，弃去流出液，先用5 mL超纯水淋洗，再用5 mL甲醇/水，甲醇/水 溶液的体积比为2/8,溶液淋洗小柱，弃去流出液，最后用5 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液 于带刻度离心管中，氮吹浓缩至近干，最后用甲醇/水溶液定容至I mL，混匀后经0.22 Mm 有机相滤膜过滤后用于上机分析； 5) 色谱条件 色谱柱：Accucore XL C18 柱，150 mmX4.6 mm，4 μπι;柱温：35°C;进样量：10 yL;流 速：0. 5 mL/min ;流动相：A为水溶液，B为甲醇溶液；梯度洗脱程序：0~0. 5 min，70%A ; 0. 5 ~7. 0 min，70%A ~10%A ;7. 0 ~8. 0 min，10% A ;8. 0 ~8. I min，10%A ~70%A ;8. 1 ~ 12. 0 min，70%A ; 6) 质谱条件 扫描方式：负模式扫描；检测方式：多反应监测（MRM);电喷雾电压（Spray voltage) :-3000 V ;鞘气（Sheath gas pressure) :207 kPa ;辅助气（Auxiliary gas flow) :10 arbitrary units;毛细管温度（Capillary Temperature) :350 °C ;蒸发温度 (Vaporizer Temperature) :30CTC ;碰撞气：氩气（I. 5mtor;r); 氯霉素和内标的质谱条件参数：
*定量离子； 7) 配制一系列不同浓度的标准工作溶液，0. 3、0· 5、1.5、3. 0、5. 0、10. 0 ng /mL，并 依次进样，分别以氯霉素的峰面积Y为纵坐标，以相应的浓度值为横坐标，作标准曲线， 结果表明，目标物在〇.3~ 10 ng/mL范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系 方程为 Y=〇. 286385*X- 0. 00152397,相关系数 R2大于 0. 998。
【专利摘要】本发明涉及一种正己烷预处理-高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中氯霉素残留量的方法，该方法试样采用正己烷预溶解形成乳浊液后加入水提取，经HLB固相萃取小柱净化，用Accucore XL C18柱分离，电喷雾离子源负离子多反应监测模式串联质谱进行测定。本发明优化了提取、净化方法和仪器测定条件等。结果表明：氯霉素在0. 3ng/mL-10ng/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数大于0.998。该方法定性限（S/N>3）为0.05 μg/kg，方法定量限（S/N>10）为0.3 μg/kg，在0.3μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg三个添加水平的回收率为80.2%-105.2%，相对标准偏差（RSD，n=6）均小于8%。本方法快速、灵敏、准确。
【IPC分类】G01N30-88
【公开号】CN104880522
【申请号】CN201510209083
【发明人】雷美康, 彭芳, 徐佳文, 余琪, 祝子铜, 吴晓勤
【申请人】衢州出入境检验检疫局综合技术服务中心
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月28日