液体向液体的生物粒子分级和浓缩的制作方法
【专利说明】液体向液体的生物粒子分级和浓缩
[0001]本专利申请要求2012年10月18日提交的美国临时专利申请系列号61/715，451的优先权，所述临时专利申请的内容在此整体通过参考并入本公开。
[0002]政府利益
[0003]本公开的主题内容在美国国土安全部(Department of Homeland Security)(DHS)授予的资助号为D12PC00287的美国政府支持下做出。美国政府在本公开的主题内容中具有一定权利。
技术领域
[0004]本公开的主题内容总的来说涉及样品制备领域。更具体来说，本公开的主题内容涉及用于分级(fract1nate)和浓缩流体样品内的物质的装置、系统和方法。
【背景技术】
[0005]检测和定量空气和液体中的粒子的困难是众所周知的。当浓度下降时，现有的系统都开始趋向失败，直至随着被分析物浓度减小，最终完全不能检测。这对国家安全造成严重问题，例如2001年的邮件炭疽病袭击和随后的反恐战争已揭示出在生物威胁物的取样和检测方面的不足之处。医学领域同样受到现有的检测限的影响，环境科学也是如此。
[0006]在生物防御和气溶胶研宄领域中，通常使用湿式旋风分离器或类似的装置将气溶胶收集在液体样品中。将气溶胶收集在水性样品中，以便可以使用主要要求样品被包含在液体中的标准技术来进行随后的生物粒子分析。这些“湿式”收集器具有许多缺点，包括:难以维持设定的流体体积，与粒子物质在装置中积累相伴的难题，以及对在变化的环境条件下储存流体的要求。
[0007]长期以来，干式滤器已被用于收集气溶胶以及从液体收集粒子。然而，干式滤器主要不能用于鉴定生物粒子，因为检测器通常要求液体样品，并且将粒子移除到液体中是极为困难的。用于从平板式滤器移除粒子的方法是常见的，但也是繁琐、低效的，且需要大量液体。
[0008]从液体浓缩粒子传统上使用离心来进行。使用离心力按照混合物中存在的各个组分的密度差来分离混合物。这种力分离混合物，在管的底部形成相对致密的材料球粒。然后可以将被称为上层清液或上清液的剩余溶液小心地从管中倾倒出来而不扰动所述球粒，或使用巴氏(Pasteur)吸管吸出。离心速率由施加到样品的加速度指定，并且通常用每分钟转数(RPM)或离心力度量。在离心中的粒子沉降速度是粒子的尺寸和形状、离心加速度、存在的固体的体积分数、粒子与液体之间的密度差和液体的粘度的函数。
[0009]与离心技术相伴的问题限制了它的适用性。微米尺寸范围内的粒子的沉降速度相当低。因此，这些粒子的离心浓缩花费数分钟至数小时。实际时间随着样品的体积、所使用的设备和操作人员的技能而变。
[0010]离心技术是繁琐的，因为它们通常由大量步骤构成，每个步骤要求操作人员进行高度浓缩。大多数微生物实验室每天通过离心处理大量样品。由于繁琐性，人为误差的可能性高，并且这些技术的自动化是困难且高成本的。离心通常还需要供电设备。因此，许多情况例如紧急响应阻碍了它们的使用。
[0011]已经探索了其他的浓缩技术，它们主要分成三种技术类别一一基于微流体/电泳、基于过滤和基于捕获的技术。然而，这些技术各自具有阻碍它们在某些情况下使用的缺点。
【发明内容】
[0012]鉴于常规技术的限制，需要的是用于将流体样品分级和浓缩成数种组分浓度的单
——盤罟
目.ο
[0013]在这样做时，本公开的主题内容提出了新的、快速、高效的、单程的基于膜滤器的分级和浓缩装置、系统和方法，其将悬浮在来自于稀进料悬液(“进料”)的液体中的粒子、特别是生物粒子分级并浓缩成经尺寸分级并浓缩的样品悬液(阻留物)，在独立的液流中排除分离的流体(透过物)。本公开的主题内容对于直径为约0.001微米至20微米的尺寸范围内的悬浮生物粒子例如蛋白质/毒素、病毒、DNA和细菌的分级和浓缩来说是特别有用的。这些粒子的浓缩对于检测稀悬液中的目标粒子来说是有利的，因为将它们浓缩到小体积中使它们更容易检测。分级以“级联”方式进行，以便将残留在分离的流体中的低于每个前一级的截留尺寸的粒子浓缩在浓缩的样品悬液中。这一过程也可用于产生“带通”浓缩，用于浓缩狭窄范围内的特定目标尺寸的粒子。所述装置使用进料侧上的压力、透过物侧上的真空和/或机械剪切来加速分离过程，并且可以包括添加的表面活性剂以提高效率。集成的气动阀、液压阀或机械阀和新的真空启动程序允许湿滤膜启动并同时减小装置中的液体滞留体积。该级联滤器堆叠体的独特之处在于所述样品流垂直于包封在外壳中的串联的滤器堆叠体的表面，每个滤器之间仅具有小的开放间隙空间，并且所述滤器的洗脱通过平行于阻留物滤器表面或与所述表面相切进行的同时的湿泡沫洗脱，通过所述小的间隙空间来进行。泡沫洗脱在每个滤器级上同时进行，使得在洗脱期间横跨每个膜的跨膜压力保持基本为零或接近于零。通过这种方式，洗脱流体通过膜的流动被消除或显著减小，使得切向流速和洗脱效率被最大化。提取泡沫可以从加压气体和溶解在收集流体中的表面活性剂制备得到。
[0014]在一种示例性实施方式中，本公开的主题内容是一种用于从流体样品分级和浓缩粒子的装置。所述装置包括含有分级式滤器(staged filters)的滤筒，所述滤器具有多孔表面且按递减的孔眼尺寸排列，用于从流体样品捕获粒子；以及与所述滤筒流体连通的渗透压力源；其中将所述粒子从所述多孔表面洗脱并分发到减小的流体体积中。
[0015]在另一种示例性实施方式中，本公开的主题内容是一种用于从流体样品分级和浓缩粒子的系统。所述系统包括容纳流体样品的储存器；包括两个或更多个分级式滤器的分级和浓缩滤筒；与所述滤筒流体连通的渗透压力装置；浓缩单元，其包括驱动集成阀，以将样品移动通过所述滤筒；以及流体分发器源，用于从滤筒分级式滤器收集浓缩的样品；其中将所述流体样品移动通过所述浓缩单元，然后将所述浓缩的样品从所述滤器洗脱并分发。
[0016]在又一种示例性实施方式中，本公开的主题内容是一种用于从流体样品快速分级和浓缩粒子的系统。所述系统包括将样品导入到样品储存器中；启动分级和浓缩循环；将所述流体样品通过一系列滤器；从每个滤器级洗脱粒径逐渐减小的大量粒子；以及从每个滤器级提取浓缩的样品。
【附图说明】
[0017]图1A示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的歧管部分。
[0018]图1B示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的夹持部分。
[0019]图1C示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的分解视图。
[0020]图2示出了本公开主题内容的示例性实施方式的五级流体装置的内部流体体积视图。
[0021]图3示出了本公开主题内容的示例性实施方式的二级流体装置的内部流体体积视图。
[0022]图4示出了本公开主题内容的示例性实施方式的三级流体装置的内部流体体积视图。
[0023]图5示出了本公开主题内容的示例性实施方式的分级和浓缩的流程图。
[0024]图6示出了本公开主题内容的示例性实施方式的双滤筒系统。
[0025]图7A示出了本公开主题内容的示例性实施方式的具有集成的滤器支承物的二级滤器堆叠体的横截面视图。
[0026]图7B示出了本公开主题内容的示例性实施方式的不具有滤器支承物的二级滤器堆叠体的横截面视图。
[0027]图8A-8X示出了本公开主题内容的示例性实施方式的用于分级和浓缩的方法的流程图和详细步骤。
【具体实施方式】
[0028]本公开的主题内容总的来说涉及生物恐怖主义安保、医学和环境科学领域。空气携带的生物威胁物的快速可靠的检测是保护平民和军人免于流行病大爆发和生物恐怖主义事件的显著需求。一流的生物威胁物检测系统使用气溶胶收集器将粒子捕获在2至12mL范围内的液体体积中。然后使用多种样品制备技术对样品进行处理，并通过快速微生物学方法(包括实时定量聚合酶链反应(qPCR)和超高通量测序(UHTS)和/或基于培养的金标准方法)进行分析。尽管快速检测器、收集器和鉴定器的技术水平在近年来已取得巨大进步，但样品制备技术的发展显著落后，在这些技术中需要相当大的改进。
[0029]用于空气携带的生物威胁物的检测/收集/鉴定系统必须在所有类型的户内和户外环境中恰当地运行。城市、工业和乡村的户外环境和户内环境包括从非常低到非常高的粒子浓度。在这些变化的环境中，威胁物的检测通常依赖于系统在可能是有机和无机碎片粒子、无害微生物、花粉、真菌孢子和哺乳动物细胞的高度变化的复杂混合物中捕获和识别稀少的威胁物粒子的能力。
[0030]需要更好的自动样品制备技术，以便可以克服目前与复杂环境样品中稀少粒子的检测相关的问题。由于粒子和化学抑制剂的变化的高度复杂的混合物，由环境碎片造成的鉴定技术的抑制是伴随这些系统的常见问题。UHTS、qPCR和其他快速检测技术也可能由于高水平的背景混杂物而失效。由高的背景混杂物水平造成的用于UHTS数据分析的生物信息学系统的故障，是在先进测序技术可以被改造以适应于自主生物威胁物检测应用之前必须克服的最大障碍之一。另外还存在的一个显著要求是，能够在来自于完整活细胞的目标因子与作为游离DNA或游离蛋白质存在的目标因子之间做出区分。不能快速确定目标粒子是完整活细胞还是仅仅作为游离DNA或蛋白质特征物(signature)(这是当前的生物威胁物检测系统中的规范)存在，就不允许组织将可能的实际恐怖主义事件与潜在灾难性的与恶作剧或自然事件相关的假警报区分开。
[0031]气溶胶样品和其他重要样品(例如表面、液体、临床、食物等)通常含有显著量和广范围的非靶碎片，包括有机和无机物质以及生物材料。如上所述，这些非靶材料可以以常见的抑制副作用显著影响样品制备和因子鉴定技术的性能。对于除去这些抑制剂来说，存在常规样品制备技术，但它们是缓慢的并且在处理体积仅为数百微升时性能最好一一显示了收集的样品量与可以通过可用技术处理和分析的体积之间的失配。这种失配将真实的系统检测限升高到显著高于所需检测限的水平，并且在只存在痕量水平的特征物(真实情况往往如此)时产生假阴性结果的显著可能性。
[0032]广范围的现有和正在开发的快速分析平台是用于检测和鉴定需求的潜在有用的技术。检测和鉴定可以提供关于完整生物体、核酸或蛋白质的线索。基于培养的分析、抗生素敏感性试验和功能测定法都要求活生物体样品。常用的核酸技术包括qPCR、UHTS和杂交阵列。ELISA和其他免疫测定技术、质谱术、层析技术以及其他技术可用于蛋白质分析。在某些情况下偏好地选择这些技术之一或者在某些情况下使用超过一种技术进行分析，存在显著的理由。此外，某些技术使其自身能够在自主检测平台中使用，而某些技术只能在实验室背景中使用。此外，难以确定哪些技术在不久的将来由于成本下降或开发出新的改进方法而获得领先。在确定可以使用何种检测和鉴定系统上的困难，确保了对能够以浓缩形式为每种潜在的分析类型提供所需样品级分的即插即用型(plug-and-play type)样品制备系统的需求。
[0033]需要稳健、快速和灵敏的检测系统，但由于在样品制备方面的缺陷，目前大多数系统不能满足这些需求。样品制备系统必须能够自主运行一个月或更长时间而不需维护。通常引起鉴定器出问题的同样的环境粒子和抑制剂，也可以引起样品制备系统故障，尤其是在长时期重复使用后。用于这些复杂样品的样品制备方法所需的时间占鉴定所需总时间的大部分，并且尽管如此，所述方法也只能处理非常小部分的可用样品。
[0034]本公开的主题内容提出了一种同时将多种组分分级的新技术。它可用于大量领域中，包括但不限于生物恐怖主义检测。例如，示例性的具体应用领域包括但不限于:
[0035]1.生物恐怖主义威胁因子的气溶胶取样
[0036]a.其中所述样品产生用于分析的液体样品
[0037]b.其中所述样品可能含有据认为对人类健康有显著威胁的目标因子
[0038]1.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从美国食品和药品监督管理局的疾病控制和预防中心(CDC)选择因子A、B或C名单获取(参见下面的名单I)
[0039]c.其中所述样品可能含有据认为对人类、动物或植物健康有威胁，造成社会混乱和经济伤害的目标因子
[0040]1.其中潜在威胁性(目标)因子的名单可以从CDC因子名单(http: "www.bt.cdc.gov/agent/agentiist.asp)2 获取
[0041]d.其中得到的样品可能含有对于通过所选方法进行检测来说浓度过低的试验粒子、目标因子或替代物
[0042]1.其中将所述样品浓缩在较小体积中，可以导致通过下列方法之一或组合来检测目标威胁因子:
[0043]1.其中威胁