一种苍柏袪痛制剂hplc指纹图谱的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药制剂质量检测领域，具体设及一种苍柏柱痛制剂HPLC(高效液相 色谱）指纹图谱的测定方法。
【背景技术】
[0002] 苍柏柱痛散组方源于甘肃省名老中医贾奇峰的经典验方，主要由苍术(款炒)、黄 柏、赤巧、防己等多味药组成，具有清热利湿，枯疲降浊，通络止痛之效。该药临床上常与别 嚷醇联合使用，W缓解痛风急性发作期的红、肿、热、痛症状，还可进一步稳定痛风患者血尿 酸水平从而控制痛风复发。然而，联合使用的别嚷醇毒副作用大，容易产生皮疹，腹泻、恶 屯、、呕吐、胃痛，手脚麻木、刺痛，过敏性血管炎等不良反应，此外苍柏柱痛散存在容易吸湿 结块、药物稳定性差、具有不良气味、患者服用剂量大，导致患者依从性差等缺点，所W新的 制剂开发势在必行。
[0003] 兰州市肺科医院制剂室对该苍柏柱痛散组方进行改进，研制出一种苍柏柱痛制 剂，其由W下中药材的有效成分组成；苍术7. 5-30重量份、黄柏7. 5-30重量份、川牛膝 5-20重量份、防己6-24重量份、赤巧6-24重量份、牡丹皮6-24重量份、细辛2. 5-10重量 份、苦参7. 5-30重量份、秦巧6-24重量份、松节7. 5-30重量份、萃游7. 5-30重量份、紫草 5-20重量份、黄花菜7. 5-30重量份、甘草1-4重量份。如何使成批生产的苍柏柱痛制剂达 到质量稳定、安全可控，是实现其产业化生产急需解决的问题之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的提供一种苍柏柱痛制剂HPLC指纹图谱的测定方法。
[0005] 本发明实现上述目的所采用的技术方案如下： 一种苍柏柱痛制剂HPLC指纹图谱的测定方法，包括如下步骤： (1) 所述苍柏柱痛制剂用己膳-磯酸提取，得到供试品溶液； (2) 供试品溶液上高效液相色谱仪检测得到HPLC指纹图谱，色谱条件为：色谱柱；C18 柱，检测波长；284nm，W己膳-0. 1%磯酸为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱时流动相中己膳 的体积比随时间变化为；〇-15min，1〇-18〇/〇 ;15-30min，18-50〇/〇 ;3〇-35min，50〇/〇。
[0006] 进一步，步骤（1)中己膳与磯酸的体积比为（36~500:巧0~64)。
[0007] 优选地，所述己膳与磯酸的体积比为36:64。
[0008] 优选地，步骤（1)所述磯酸的浓度为0.1~0.2%。
[0009] 进一步，步骤（1)所述提取的方式为加热回流提取或超声波提取。
[0010] 进一步，所述苍柏柱痛制剂由W下中药材的有效成分组成： 苍术 7. 5-30重量份 黄柏 7. 5-30重量份 川牛膝 5-20重量份 防己 6-24重量份 赤巧 6-24重量份 牡丹皮 6-24重量份 细辛 2. 5-10重量份 苦参 7. 5-30重量份 秦巧 6-24重量份 松节 7. 5-30重量份 萃游 7. 5-30重量份 紫草 5-20重量份 黄花菜 7. 5-30重量份 甘草 1-4重量份。
[0011] 进一步，所述HPLC指纹图谱特征峰归属的鉴定； 取盐酸黄柏碱、龙胆苦巧、巧药巧、粉防己碱、盐酸小窠碱对照品，用己膳-磯酸溶解， 制成混合对照品溶液； 按苍柏柱痛制剂的中药材组成，分别制备不含黄柏、苦参、秦巧、防己、赤巧的阴性样 品，再用己膳-磯酸提取，得到阴性样品溶液； 将阴性样品溶液W及混合对照品溶液上高效液相色谱仪检测，分别得到阴性样品和对 照品的图谱； 根据供试品、阴性样品和对照品的图谱确定HPLC指纹图谱特征峰的归属。
【附图说明】
[001引图1为对照品、样品、阴性样品的HPLC指纹图谱； 图2样品的HPLC指纹图谱； 图3为10批次样品的HPLC指纹图谱。
【具体实施方式】
[0013] 下述实施例只是用于说明本发明而不是限制本发明。实施例中所用的试剂和仪器 如未进行特别说明，均为可从一般商业渠道获得的常规试剂和仪器。
[0014] 实验例；苍柏柱痛制剂HPLC指纹图谱的测定 1材料和方法 1. 1仪器与试药 高效液相色谱仪（Waters2695,美国），PDA检测器（Waters2998)，Empowers色谱工作 站，色谱柱WatersXSELECTCSH-C18 (4.6mmX150mm，5ym)。
[001引盐酸小窠碱对照品册号110713-201212 )，盐酸黄柏碱对照品册号 111895-201202)，龙胆苦巧(批号 110770-201314)，巧药巧(批号 110736-201438)，粉防己 碱(批号110711-200708)均购自中国食品药品检定研究院，苍柏柱痛制剂（胶囊）（兰州 市肺科医院制剂室生产，批号分别为 20130828、20130925、20131017、20131126、20131218、 20140121、20140226、20140312、20140415、20140513)。己膳为色谱纯试剂，其他试剂均为分 析纯，水为超纯水。
[0016] 1.2方法 1.2.1色谱条件1.2.1.1色谱条件的建立 W盐酸黄柏碱为考察指标，比较不同洗脱方式、流动相组成和比例下，盐酸黄柏碱的含 量和各个目标峰的分离度，从而建立指纹图谱分析方法的色谱条件。即取本品样品，混匀， 研细，取约2g，精密称定，用甲醇-水（36:64)超声处理（功率250W，频率50曲Z) 45分钟， 取出，放冷，再称定重量，用甲醇-水（36:64)补足减失的重量，混匀，滤纸滤过，取续滤液， 用0. 45ym微孔滤膜过滤，即得。
[0017] 1. 2. 1. 2提取方法的建立 在1. 2. 1. 1建立的色谱条件下测定盐酸黄柏碱含量，考察不同提取方法和不同提取溶 剂的差异。
[0018] 1. 2. 1. 3检测波长的确定 对样品全波长扫描，其中盐酸黄柏碱^。。,=284皿、龙胆苦巧A。。,=254皿、巧药巧 入"x=274. 8皿和230皿、粉防己碱^。。,=280皿、盐酸小窠碱^。。,=265皿。提取不同吸收波长 的色谱图，选择最佳检测波长。
[0019] 1.2. 2方法学考察 1. 2. 2. 1供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品样品，混匀，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加 入己膳-0. 1%磯酸（36:64,V/V) 25血，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50曲Z) 30分钟，取出，放冷，再称定重量，用己膳-0. 1%磯酸（36:64巧h足减失的重量，混匀，用定量 滤纸过滤，弃去初滤液，收集续滤液，用0. 45ym微孔滤膜过滤，即得。
[0020] 1. 2. 2. 2阴性样品溶液的制备 按苍柏柱痛制剂的处方分别制备不含黄柏、苦参、秦巧、防己、赤巧提取物的阴性样品， 按"1. 2. 2. 1"项下供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
[0021] 1.2. 2. 3对照品溶液的制备 精密称取对照品盐酸黄柏碱、龙胆苦巧、巧药巧、粉防己碱、盐酸小窠碱适量，分别用己 膳-0.1%磯酸（36:64)溶解，配成浓度分别为 1.880、1.920、27.400、1.100、1.056111肖.111。 的单一对照品溶液。分别吸取各对照品溶液0. 4mL、3. 0血、0. 2血、1. 0血、1. 4mL置10血 量瓶中，^己膳-〇.1%磯酸（36:64)定容，摇匀，得质量浓度分别为0.0752111肖-111。盐酸黄 柏碱、0. 5760mg?m。的龙胆苦巧、0. 548mg?血-1的巧药巧、0.llOmg?血-1粉防己碱和 0. 1478mg?m。盐酸小窠碱混合对照品溶液。
[0022] 1. 2. 2. 4精密度试验 取同一批号苍柏柱痛制剂的供试品溶液，连续进样6次，W龙胆苦巧作为参照峰，考察 各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的一致性。
[0023] 1. 2. 2. 5重复性试验 取同一批号苍柏柱痛制剂供试品5份，每份2.Og，按"1. 2. 2. 1"项下所述方法制备供试 品溶液，进样测定。
[0024] 1. 2. 2. 6稳定性试验 取同一批号苍柏柱痛制剂的供试品溶液，分别在0, 2,4, 8,12,16, 24h进样测定。
[00巧]1. 2. 3指纹图谱建立 1.2. 3. 1HPLC指纹图谱的测定 取 10 批（S1 ;20130828、S2 ;20130925、S3 ;20131017、S4 ;20131126、S5 ;20131218、S6 ; 20140121、S7 ;20140226、S8 ;20140312、S9 ;20140415、S10 ;20140513)苍柏柱痛制剂样品， 按"1. 2. 2. 1"项下方法制备供试品溶液，在已确定的色谱条件下进样分析，即得样品HPLC 指纹图谱。
[0026] 分别将不含黄柏、苦参、秦巧、防己、赤巧提取物的阴性样品W及对照品按上述色 谱条件测定。
[0027] 1. 2. 3. 2共有峰的确定 根据10批苍柏柱痛制剂样品的图谱找出共有峰，选择保留时间适中，峰面积适宜，重 现性好的共有峰做为参照峰，将其保留时间和色谱峰面积记为1，计算其他共有峰的相对保 留时间和相对峰面积。
[0028] 根据阴性样品W及对照品的图谱对上述找出的共有峰进行归属确认。
[0029] 1. 2. 3. 3样品相似度评价 将实验数据导入国家药典委员会开发的"中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版"计算软件，采用夹角余弦法计算10批苍柏柱痛制剂样品之间指纹图谱的相似度（W全 图谱的峰计算）。一般情况下，相似度大于0. 9即认为相似度良好。
[0030] 2.结果 2. 1色谱条件 2. 1. 1色谱条件的建立 表1通过不同流动相测定的盐酸黄柏碱含量（yg/g) (n=3)
注： 1、梯度洗脱方式 1 ;〇-15min,l〇-18〇/〇A;15-30min，18-50〇/〇A;3〇-35min，50〇/〇A。
[0031] 2、梯度洗脱方式 2 ;0-15min,l〇-30〇/〇A;15-30min，3〇-50〇/〇A;3〇-35min，50〇/〇A。
[0032] 3、梯度洗脱方式 3 ;0-15min,l〇-50〇/〇A;15-30min，5〇-80〇/〇A;3〇-35min，80〇/〇A。
[003引 4、"0-15min, 10-50%A"表示从第0至第15分钟，流动相中A的体积比由10%线 性变化至50%，其它的依此类推。
[0034] 5、柱温30°C，流速为1. 0血?min-1，检测波长284nm，进样量10yL。
[00巧]流动相采用甲醇-水或己膳-水时，除盐酸黄柏碱W外的其他目标峰分离度均 差，且当流动相为甲醇-水（50:50,V/V)时，盐酸黄柏碱峰形差无法计算其含量。而当水 相改为磯酸后，盐酸黄柏碱峰形明显改善，且梯度洗脱明显优于等度洗脱。在梯度洗脱中， 己膳（A)体积比例变化过快时，盐酸黄柏碱的分离度R<1. 5,无法计算其含量。其中采用 己膳-0. 2wt%磯酸时，目标峰分离均好，但粉防己碱的特征峰出现拖尾，且磯酸浓度过高 易出现色谱柱堵塞情况。故选择己膳-0.Iwt%磯酸作为流动相进行梯度洗脱（0-15min, l〇-18〇/