使用的试验为商业销售的AmniSure?ROM试验，由AmniSure? International, LLC, Boston, MA, USA制造。在此前关于PAMG-1对于检测ROM的实用性研 究中，注意到在AmniSure? ROM试验为阳性且标准临床评估（例如硝嗪、羊齿样和混合集 中）为阴性的23个病例中的20例中，在对患者的临床过程回溯分析时，患者最终被确定为 已经破膜（见Lee SE等人，Obstet Gynecol 2007;109:634 - 640)。稍后报道，对于表现 出分娩迹象和征兆组别中所有的预产期前患者，在随后7天内发生分娩（见Lee SM等人， J Matern Fetal Neonatal Med 2009;22:305 - 310)。还研究了在出现早产（PTL)迹象和 征兆但是没有ROM的病人中阳性AmniSure?ROM试验的临床值。结果表明AmniSure@ ROM试验对48小时、7天和14天以内这些患者的分娩有预测性（见Lee MS等人，J Matern Fetal Neonatal Med. 2012 S印；25 (9): 1690-8)，但 PPV 不是最优的。
[0036] 虽然不意图受任何一种特定的作用理论或机制限制，但相信本方法通过提供检测 阴道分泌样品中PAGM-1的灵敏度相比于特定的当前可得的诊断方法增加的诊断试验，而 至少部分提供优越的性能，例如PPV和NPV，以及灵敏度（SN)和特异性（SP)等性能。例如， 虽然当前可得的检测PAMG-1的试验利用5ng/ml的检测阈值，但目前发现将检测阈值调节 至4ng/ml提供令人吃惊地改善的诊断试验（例如高PPV和高NPV)。出乎意料的是4ng/ml 的检测阈值可用于以高PPV预测TTD的方法，如目前所公开的，由于将检测阈值降至低于 5ng/ml预期将升高假阳性结果的频率，由此降低试验的PPV。此外，之前没有意识到检测低 于5ng/ml的PAMG-1浓度将对预测TTD有用，因为如此小的浓度被认为几乎没有临床意义。
[0037]目前还发现，为了确保诊断方法的高度准确性，适合根据本文公开的方法预测TTD 的孕妇的理想妊龄特别地在20周和36周6天之间。同样，在某些实施方案中，对于有3cm 以下的宫颈扩张的患者群体，本文公开的TTD试验具有高NPV和高PPV，以及高SN和SP。
[0038] 在某些实施方案中，如果孕妇具有在20周和36周6天之间的孕龄，则其适合于和 /或被选择来预测TTD。在某些实施方案中，如果孕妇具有25_以上的宫颈长度和/或3cm 以下的宫颈扩张，则其适合于和/或被选择来预测TTD。
[0039] 在诊断试验中，PPV，或者叫准确率，是阳性试验结果为真阳性（例如正确的诊断） 的比例。因为其反映了阳性试验反映欲测试的潜在状况的可能性，所以它是诊断方法性能 的关键量度。其它重要的量度包括阴性预测值（NPV)、灵敏度（SN)和特异性（SP)。NPV表 示具有阴性试验结果又正确地鉴别为没有欲测试的状况的受试者比例。对于给定的试验， 高NPV表示当试验获得阴性结果时，其评估很可能是正确的，且很少产生假阴性结果。因 而，对于预测临近的分娩（例如在特定的时间框架以内），高NPV意味着当分娩事实上临近 时，试验很少预测分娩不临近。也可将诊断试验（例如在临床研究中）取得的真阳性结果 和真阴性结果的数目结合来确定诊断试验的灵敏度（SN)和特异性（SP)。
[0040] PPV可根据下式计算：
[0041 ]
[0042] NPV可根据下式计算：
[0043]
[0044] SN可根据下式计算：
[0045]
[0046] SP可根据下式计算：
[0047]
[0048] 在某些方面，本文公开的方法对于预测14天以内的TTD具有至少约77%的PPV。 在具体的实施方案中，预测14天以内的TTD的PPV为约90. 9% (例如约91 % )。在另一具体 的实施方案中，预测约14天以内的TTD的PPV为约87%。应理解本方法也涵盖了对于预测 约 14 天以内的 ITD，具有至少约例如 75%、76%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%的PPV的方法。在某些方面，预测约14天以内的TTD的PPV在约70%-100%、约 80-% -100%、约 85% -100%或约 90% -100%的范围。
[0049] 本文公开的方法对于预测约7天以内的TTD具有至少约64%的PPV。在具体的 实施方案中，预测约7天以内的TTD的PPV为81. 8%。在另一具体的实施方案中，预测约 7天以内的TTD的PPV为约78. 3% (例如约78% )。应理解本方法也涵盖了对于预测约7 天以内的 TTD，具有至少约例如 65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、 75%、76%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84% 85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的卩卩￥的方法。在某些方面，预 测 7 天以内的 TTD 的 PPV 在约 60 % -100 %、约 65 % -100 %、约 70 % -100 %、约 75 % -100 % 或约80% -100%的范围内。
[0050] 另一方面，本文公开的方法具有对于预测约48小时以内的TTD至少约39 %的 PPV。在具体的实施方案中，预测约48小时以内的TTD的PPV为45. 5%。应理解本方法也 涵盖了对于预测约48小时以内的TTD，具有至少约例如40 %、41 %、42 %、43 %、44 %、45 %、 46%、47%、48%、49%、50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 61 %、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71 %、72%、73%、74%、75%、 76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84% 85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的卩卩￥的方法。在某些方面，对 于用本方法预测约48小时以内的TTD，PPV在约39% -100%、约40% -100%或约45-100% 的范围内。
[0051] 在某些方面，根据本文公开的方法预测TTD，对于预测约48小时、7天或14天以内 的 TTD，NPV 为至少约 90% (例如约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或 100% )。
[0052] 在某些方面，根据本文公开的方法预测TTD，对于预测约48小时、7天或14天以内 的 TTD 而言，SN 为至少约 70% (例如至少约 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。
[0053] 在某些方面，根据本文公开的方法预测TTD，对于预测约48小时、7天或14天以内 的 TTD 而言，SP 为至少约 70% (例如至少约 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。
[0054] 在某些实施方案中，本方法提供对于预测约14天以内的TTD具有约90. 9%的 PPV，和/或约93. 6 %的NPV，和/或约80 %的SN，和/或约97. 3 %的SP的诊断试验。在某 些实施方案中，本方法提供对于预测约14天以内的TTD具有约91 %的PPV，和/或约94% 的NPV，和/或约80%的SN，和/或约97. 3%的SP的诊断试验。
[0055] 在某些实施方案中，本方法提供对于预测约14天以内的TTD具有约87 %的PPV、 约93. 6 %的NPV、约80 %的SN和约96. 1 %的SP的诊断试验。在某些实施方案中，本方法提 供对于预测约14天以内的TTD具有约87 %的PPV、约94 %的NPV、约80 %的SN和约96 % 的SP的诊断试验。
[0056] 在某些实施方案中，本方法提供对于预测约7天以内的TTD具有81. 8 %的PPV、 97. 4 %的NPV、90 %的SN和95 %的SP的诊断试验。
[0057] 在某些实施方案中，本方法提供对于预测约7天以内的TTD具有约78. 3%的PPV， 和/或约97. 4%的NPV，和/或90%的SN，和/或约93. 8%的SP的诊断试验。在某些实施 方案中，本方法提供对于预测约7天以内的TTD具有约78 %的PPV，和/或约97 %的NPV， 和/或90%的SN，和/或约94%的SP的诊断试验。
[0058] 在某些实施方案中，本方法提供对于预测约48小时以内的TTD具有约45. 5%的 PPV、约100 %的NPV、约100 %的SN和约86. 7 %的SP的诊断试验。
[0059] 应理解，可调节上述数值和范围从而包括置信区间（例如95%置信区间），如在下 文的实施例2、表2和4中所示。
[0060] 本文公开的方法对确定患者（例如孕妇）的早娩风险也有用。早娩在本文中定义 为在37周妊龄之前分娩。根据本文公开的方法获得的阳性的试验（即在阴道液样品中检 测到PAMG-1处于不低于预定的检测阈值的水平）指明患者面临早娩风险。在某些实施方 案中，如果患者出现下列迹象的至少一项，则选择该患者来测试早娩风险：（i) 20周和36周 6天之间的妊龄；和/或（ii)宫颈长度25mm以上；和/或（iii)宫颈扩张3cm以下。
[0061] 本文公开的方法对确定孕妇的绒毛膜自发破裂（ROM)，例如预产期前过早ROM的 风险也有用。自发ROM通常作为正常分娩过程的一部分而发生。然而预产期前过早的 ROM(例如在到达37周妊龄之前）也可发生。如能确定患者的自发ROM包括预产期前过早 ROM的风险则会很有利，因此如有必要可进行适当的介入测量（例如给予安胎药来延长妊 娠、给予皮质激素来改善胎儿的呼吸发育、给予抗生素来降低感染风险（产时和产后）、建 议卧床休息和/或增加观察和胎儿监测）。在某些实施方案中，如果患者出现下列迹象的至 少一项，则选择该患者来测试自发ROM风险：（i) 20周和36周6天之间的妊龄；和/或（ii) 宫颈长度25mm以上；和/或（iii)宫颈扩张3cm以下。
[0062] PAMG-1
[0063] PAMG-1于1977年由D. Petrunin从羊水中分离，并起初被称作胎盘特异的a -1 球蛋白(specific alpha-1 globulin of placenta) (D. Petrunin等人，〃Immunological Identification of Organ Specific alpha-lGlobulin of Human Placenta and Its Content in the Amniotic Fluid, "in Akusherstvo i Ginekologiya,1977,N 1，pp.64-65,Moscow, USSR)〇
[0064] 从孕妇羊水中分离PAMG-1的示例性步骤概述于表1中并在下文讨论。然而应理 解，PAMG-1可根据现有技术中已知的任何合适的方法，从任何合适的来源分离。
[0065] 表1:分离PAMG-1的示例性步骤
[0066]
[0067] PAMG-1从16至25周妊娠的妇女的羊水中分离。液体取自由于医学考虑而终止 妊娠的妇女。将氯化镧的10%溶液按20:1的体积比添加至羊水（使得氯化镧的终浓度为 0. 5% )并在4°C保持18小时。通过8, OOOrpm下离心30分钟来进一步分离沉淀。沉淀溶 解在Na2HP04饱和溶液中，然后分离不溶镧盐沉淀（在8, OOOrpm离心30分钟的过程中产 生）。用50%饱和硫酸铵在4°C温育18小时将所得溶液分级，并将所得的沉淀溶解在蒸馏 水中，使得溶解的沉淀组分体积恢复至羊水初始体积。然后用60%饱和硫酸锂沉淀溶液，并 将沉淀溶解在少量蒸馏水中。透析之后，通过向蛋白质溶液添加等体积吸湿剂而用焦磷酸 钙吸附掺和物，混合并温育10-15分钟，并通过离心将吸收剂分离。
[0068] PAMG-1的分子量首先报道为32kDa(Boltovskaya, M.N?等人，〃Histochemical and Clinico-Diagnostic Study of the Placental Alpha-Microglobulin[PAMG-1] Using Monoclonal Antibodies,"in Bulletin of Experimental.Biology and Medicine, 1991，No. 10, pp. 397-400);然而现在通常接受的是，PAMG-1具有34kDa的分子量 (见，例如Pollet-Villard等人（Amer J Perinatol 2011Jun;28(6):489_94))。PAMG-1 是出现在孕妇的血清、羊水和阴道分泌物中的蛋白质。PAMG-1在羊水中存在的浓度至少是 孕妇血清中的浓度的100倍，且至少是没有胎膜破裂的孕妇的阴道分泌物中的浓度的3000 倍。结果，甚至当少量羊水（按每lml阴道分泌物约一滴的1/100)溶解在阴道分泌物样品 中时，足量的PAMG-1就存在于该阴道分泌物样品中而指示胎膜破裂已经发生。此外，由于 血清中PAMG-1浓度低，血清向阴道液样品不显著的掺和（10-15%)并不影响本
【发明内容】
的 装置和方法所产生的结果。已表明对于ROM的诊断，检测PAMG-1要优于检测其它羊膜蛋白 质，例如28kDa的蛋白质IGFBP-1(见Pollet-Villard等人（上文）和European Guidelines on preterm labor (The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine, 2011 ；Early Online, 1 - 9))〇
[0069] 由于阴道分泌物中羊水的出现可对胎膜破裂有指示性，在阴道分泌物中检测羊膜 蛋白质PAMG-1可用于检测胎膜破裂。然而现在发现可使用本文公开的方法，在甚至没有可 检测的ROM时检测阴道分泌物中的PAMG-1，通过将PAMG-1的检测阈值调节至约4ng/ml而 准确地预测TTD。虽然不意图受理论限制或限于任何一种特定的作用机制，但相信在分娩临 近（即分娩将在例如14天、7天或48小时以内发生）时发生的宫缩期间，PAMG-1通过胎膜 中的绒毛膜羊膜孔漏出。由于分娩的炎性过程或感染而发生的细胞外基质降解也可导致在 宫颈-阴道分泌物中发现PAMG-1水平升高。
[0070] PAMG-1抗体
[0071] 本文公开的方法涵盖在取自孕妇的阴道分泌物样品中检测PAMG-1蛋白质的存 在。PAMG-1蛋白可根据现有技术中已知的任何合适的方法来检测。
[0072] 检测阴道液样品中的PAMG-1的示例性方法包括但不限于使用例如本文记载的 PAMG-1特异性抗体（例如单克隆抗体或其抗原结合片段）的免疫测定（例如ELISA)。
[0073] 如本文所公开的PAMG-1抗体可检测极低浓度的PAMG-1。例如，可检测浓度为 0. 05ng/ml的PAMG-1。由于与羊水中约1680ng/ml的PAMG-1最小浓度相比，血清中PAMG-1 的最大浓度仅约为25ng/ml，又由于阴道分泌物中PAMG-1的背景浓度很低，约0. 2ng/ml，故 较低的PAMG-1阈值水平可用在本发明用于检测阴道中羊水的出现的方法中。目前发现对 于PAMG-1的约4ng/ml的预定义阈值可用于本文公开的方法。
[0074] 结果，本
【发明内容】
的装置和方法不受阴道炎或其它变异因素出现的影响，这些因 素对检测胎膜破裂的现有方法的准确性有负面影响。炎症渗出物中PAMG-1的最大浓度为 3ng/ml (见，例如Fuks等人的美国专利7, 709, 272号）。如果血清向阴道分泌物的掺和不 超过10-15%，可产生相同的PAMG-1浓度。此外，血清PAMG-1与羊水PAMG-1的浓度之比大 使得本发明的装置和方法即使PAMG-1检测阈值低也显著地很少倾向于产生由出现在阴道 分泌物中的血清所致的假阳性结果。
[0075] 本
【发明内容】
提供以4ng/ml的PAMG-1检测阈值预测TTD的方法和装置。检测阈值 可通过选择具有对PAMG-1的特异性结合亲和力的PAMG-1抗体（例如一对PAMG-1结合抗 体），例如提供所期望的检测阈值的PAMG-1结合抗体的组合而调节。也可调节检测阈值，例 如通过在试验区（例如图1和2中的试验区）使用至少一种附加的对PAMG-1的抗体来调 节预定的检测阈值（见Fuks等人的美国专利7, 709, 272号），或通过调节试验过程，如下文 详细讨论的。
[0076] 从体液分离的重组或通过化学合成产生的PAMG-1多肽及其片段或其它衍生物或 类似物包括融合蛋白，可用作免疫原来产生识别PAMG-1多肽的抗体。本文公开的抗体可包 括免疫球蛋白的任何同种型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类（例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类的免疫球蛋白重链。PAMG-1抗体可兼具重链和轻链。
[0077] 抗体（包括全长抗体）、单克隆抗体（包括全长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异 性抗体（例如双特异性抗体）、人类、人源化或嵌合抗体和抗体片段，例如Fab片段、F(ab'） 片段、Fab表达文库产生的片段、上述任何的表位结合片段，以及工程化形式的抗体，例 如scFv分子，只要它们展现出期望的活性，例如结合至PAMG-1，都可用于实施本文公开的 方法。抗PAMG-1抗体，例如本文所公开的，可识别来自一种或多种不同哺乳动物物种的 PAMG-1。可选地，本文公开的抗体可对单独一种形式的PAMG-1特异。在某些实施方案中， 抗PAMG-1抗体对人类PAMG-1特异。
[0078] 表位可由邻接的氨基酸形成，或由通过蛋白质三级折叠而并置的非邻接氨基酸形 成。由邻接氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常可保持，然而通过三级折叠形成 的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括，例如X-射线晶 体学和二维核磁共振。见，例如Epitope Mapping Protocols in