标记。具体地，可利用反 应性标记，使得例如抗体会在抗原捕捉之前呈现金色，并且会在捕捉时变为紫色。
[0108] 如上所述的捕捉部在检测部的下游，包括不可逆地固定于固体载体上的捕捉抗体 (例如单克隆抗体），各抗体固定在捕捉部的不同位置。抗体和必要的试剂用标准现有技术 固定在固体载体上，如此前讨论的流通型免疫测定装置中所讨论的。通常，抗体吸收在固体 载体上是非极性蛋白质结构和非极性载体基质材料之间疏水相互作用的结果。
[0109] 本
【发明内容】
的免疫色谱测定技术的特别优点在于其克服了这些测定不能提供定 量数据的问题。于是，捕捉部可包含对PAMG-1特异的固定化抗体的混合物，使得信号仅在 样品中PAMG-1的量超过期望的检测阈值时产生。
[0110] 此外，本
【发明内容】
考虑使用均相免疫测定形式。此类竞争性均相法的一个实例见 于Rubenstein和Ullman的美国专利号3, 817, 837,其记述了配体和酶结合配体对抗体结合 位点进行竞争的技术。由于抗体对酶结合配体的结合改变其酶活性，配体存在的浓度可通 过测定此混合物将底物转化为产物的速率来估计。因而，在均相法中，标记的可检测性质取 决于是否结合而固有地不同。标记在其结合状态下会具有较大或较小的信号强度。通常， 抗体对标记配体的结合造成信号强度降低，例如当标记为酶时。此类别中代表性的产品包 括来自Syva Company的酶免疫测定EMIT线和来自Abbott Diagnostics的焚光极化免疫 测定IDX线。特定的均相测定可通过所有分析物在珠上的分布而制备，在此过程中将引入 样品，并且此后将珠旋转下来并检测。
[0111] 可根据本
【发明内容】
使用的生物诊断装置的其它实例包括G.Grenner，P. B. Diagnostics Systems, Inc?在美国专利 4, 906, 439 和 4, 918, 025 号中记述的装置。 Grenner' 439装置包括诊断试验元件，和以具备有多条用于将样品运送至试验元件的沟槽 的层为特征的样品施加单元。Grenner' 025涉及一种装置，其包括样品引入部件，例如附近 安装了包含固定试剂的毛细管和储废液器的膜。样品沉积之后，固定试剂从毛细管的释放 使反应终止，过量的液体由储废液器保留，因而该装置是自包含的。
[0112] 虽然优选使用膜的测定，但应理解，其它技术和相应的传感装置可同样地按照与 上文相似的方式使用。目前有若干类型的自动测定设备可用，其可同时在多个样品上承担 测定。自动测定设备包括连续/随机获取测定设备。此类系统的实例包括PB Diagnostic System, Inc?的 OPUS?和 Abbott Laboratories of North Chicago, 111?于 1988 年引入 的頂X? Analyzer。一般来说，试验液体的样品通常提供于样品杯中，并且所有处理步骤， 包括将样品吸移至测定试验元件中、温育和读取所获的信号，都自动进行。自动测定系统通 常包括一系列的工作站，各自进行试验过程的某一步骤。可通过各种部件，例如旋转传动 带或可移动架来将测定元件从一个工作站运送到下一个工作站，从而使试验步骤次序地完 成。测定元件也可包括供存储试剂、混合液体、稀释样品等的储蓄器。测定元件也包括开 口来实现将预定量的样品液及必要时的其它需要的试剂加至多孔构件。样品元件也可包 括窗口，使得信号作为处理步骤的结果而获取，典型地为出现在多孔构件上的试剂的荧光 或比色变化，其通过包括在测定系统中的光谱测定或荧光计部件来读取。PB Diagnostic Systems, Inc?的自动测定仪器记述于美国专利5, 051，237 ;5, 138,868 ;5, 141,871和 5, 147, 609 号。
[0113] 可用于实践本文所公开方法的进一步的免疫化学分析系统类别为生物传感器或 光学免疫传感系统。一般而言，光学生物传感器是用光学原理定量地将所关注的化学或生 物化学浓度或活性转化为电信号的装置。这些系统可分组为四个主要类别：反射技术；表面 等离子体共振；光纤技术和集成光学装置。反射技术包括椭圆光度法、多重积分反射光谱和 焚光毛细管填充装置。光纤技术包括倏逝场焚光（evanescent field fluorescence)、光纤 毛细管和光纤焚光传感器。集成光学装置包括刨床倏逝场焚光（planer evanescent field fluorescence)、输入分级親合免疫传感器（input grading coupler immunosensor)、 Mach-Zehnder 干涉仪、Hartman 干涉仪和差分干涉传感器（difference interferometer sensor)。结合反应的全息检测通过检测全息图像的存在而完成，该图像是在结合对的反应 物之一结合至结合对的固定化的第二反应物时以预定的图像位置形成的（见1994年10月 4日授予Lichtenwalter等人的美国专利5, 352, 582号）。光学免疫传感器的实例大体上记 述于 G.A. Robins 的综述文章（Advances in Biosensors)，Vol. 1,229-256 页，1991。这些 装置更具体的记述见于例如美国专利4, 810, 658 ;4, 978, 503和5, 186, 897号；R. A. Brady 等人（Phil. Trans. R. Soc. Land. B 316, 143_16〇, I987)和 G. A. Robinson 等人（于 Sensors and Actuators, Elsevier, 1992) 〇
[0114] 本
【发明内容】
的方法和相应的试剂盒能够并入且用于多种光学测定系统中。具体 地，虽然本
【发明内容】
的试剂盒和材料可在免疫测定形式中使用，此类形式本身也能够在多 种光电检测系统中实施。更具体地，已知多种光学免疫传感器在本文公开的方法的实践中 可受促进和实现。于是，例如反射技术、表面等离子体共振、光纤波导技术和集成光学装 置等装置和技术均可被采用，并根据本方法特别地配置来检测和显示患者生物样品检查 结果。存在特别的反射技术，例如反射测定和椭圆光度法，以及光纤、光波导、荧光毛细管 填充装置和集成光学生物传感器的具体使用，也可应用一些变体技术和设备。这些装置 的大体综述可见于 Robinson, G. A.，Optical Immunosensors:An Overview, Advances in Biosensors, Vol. 1，229-256 页（1991)〇
[0115] 更具体地，椭圆光度法依靠偏振光束的方向，首先对着参比表面（标准），此后对 着样品表面，接下来可进行结果反射的性质和程度的比较。特别地，分析物向受体分子的结 合将测定为表面厚度相对于参比表面的连锁。
[0116]以多重内反射光谱（multiple internal reflection spectroscopy)为例，例如， 配体及其受体可共价地固定在平面融合石英波导的光学表面上，此后光束可在波导中内部 反射，并会穿透入临近波导的溶液，因而折射差可测定为标准和样品之间的差。在该特定的 形式中，可联合荧光标记，并由此进行荧光测定来确定当前结合的程度。
[0117]另外的技术使用称为荧光毛细管填充装置的技术。在此特定技术中，使用由毛细 管尺度的缝隙隔开的两块玻璃板。受体分子可固定化于也充当光波导的基板上。可进行利 用FITC标记的竞争性或夹心测定，且诱导的荧光耦合入具有来自与结合源相反的结合的 信号的波导。此类信号通过其激发波导时的角度发散来区分。也制备了表面等离子体共振 (SPR)装置，其响应薄金属膜上的入射光与金属膜中与集体电子震荡相关的表面模式的耦 合而运行。共振条件取决于金属膜的光学特征、厚度、任何一面的介电折射率和光入射角。 受体分子结合至金属膜的顶面，且光在膜的底面引导，例如通过棱镜衬底。靶分析物在结合 至这些受体时，由于其产生的局部折射率的变化，将会引起共振条件的偏移。共振通过监控 金属膜表面上的光束入射角变化时的反射光强度来观察。共振角度的变化将与分析物结合 量直接相关。
[0118] 涉及光纤系统的技术包括倏逝场荧光。在此实例中，覆层从光纤末端除去，于是产 生与周围介质倏逝地相互作用的传感器元件。受体分子结合至暴露的纤维表面，并且可利 用受体与缀合蛋白质的天然荧光来进行直接测定。竞争性或夹心测定可使用FITC标记来 进行，以便获得更大的灵敏度。运行中，光波耦合入纤维，且一部分倏逝地产生的荧光耦合 返入纤维并扩散返回至检测器。
[0119] 进一步的技术使用涉及光纤毛细管的光纤技术，其中裸露的光纤包围在圆柱形填 充腔中，产生与紧接围绕纤维的填充体积部分倏逝地相互作用的传感器元件。受体分子可 结合至暴露的纤维表面，并且可进行夹心或竞争性取代测定。光波可耦合入纤维，且一部分 倏逝地诱导的荧光将耦合返入纤维并扩散返回至检测器。来自靶分析物的信号相对背景源 通过其激发纤维时的角度发散来区分。可使其它光纤技术例如光纤荧光适合于本文公开的 利用某些上文阐述的相同原理的方法。
[0120] 进一步的光子技术例如干涉分析法包括设置具有例如双路径的薄膜波导，第一路 径上可固定受体分子，而第二路径被掩蔽，从而提供参比通道。举例来说，激光可耦合入波 导并分开两条路径，因而覆盖物的折射率和厚度可通过光束相移的结果来检测，其将相应 地与分析物结合量相关。该方法的变型在制备了单路径多模式薄膜水平波导的Hartman干 涉分析中鉴别。受体分子可固定在该路径上，且来自激光的光可耦合入波导，因而两种模式 向下扩散至路径。多模式几何的光学是这样的：高阶模式具有大的倏逝场，提供信号机制， 而低阶模式实质上不具有倏逝场，提供参比机制。与靶分析物的结合会导致将由高阶模式 倏逝场检测的路径上的覆盖层的厚度和折射率的相关变化，造成该模式中的相移。鉴于低 阶或参比模式无视此类变化，将不会感受到相移，且信号和参比束之间的测定差将能够关 联确定分析物结合量。
[0121] 虽然上文的讨论提供了一般术语和一些细节，多种光学传感器技术中可用的技术 可适应本
【发明内容】
的实践。应理解，上面的陈述绝不是详尽无遗或限制性的，鉴于可采用多 种现有的技术，将成功地测定结合中的差异，并因此测定此处各自的目标标志或分析物的 存在和量。当然，如上文所强调的，无论使用何种技术，本文公开的方法的实践包括至少三 种分析物的同时检测和测定。
[0122] 检测PAMG-1的免痔色谱方法
[0123] 根据本
【发明内容】
的PAMG-1检测方法的实施方案记述如下。
[0124] 在本方法的一个实施方案中，PAMG-1在样品中通过下列方法检测：含PAMG-1的样 品与根据本文公开的方法的免疫测定系统接触而形成抗体-PAMG-1复合物。然后检测抗 体-PAMG-1复合物。在本实施方案的一种变型中，抗体包括可检测标志，检测抗体-PAMG-1 复合物的步骤包括可检测标志。
[0125] 在本方法的另一实施方案中，PAMG-1在样品中通过下列方法检测：使样品与对 PAMG-1有高度特异结合亲和力的抗体（如M271，作为下文的范例）接触，因而形成抗体 M271-PAMG-1复合物。然后复合物与固定化的二抗（例如M52)接触。二抗免疫地与一抗 相区别（例如，结合至不同的表位），因此这些抗体可同时结合至PAMG-1分子。固定化的抗 体结合至移动的抗体-PAMG-1复合物，从而形成固定化的抗体-PAMG-1-抗体复合物。通过 检测此异源三聚体复合物（heterotrimer complex)而检测PAMG-1。如上所述，对PAMG-1 特异性高的抗体优选用于PAMG-1的最初识别。
[0126] 当上述方法包括所选的以可检测标志标记的抗体对的抗体之一的使用时，该方法 的变型包括，在样品与固定化的二抗接触之前，使样品与标记的一抗接触。在此变型中，标 记的抗体的作用是结合至样品中的PAMG-1。而本方法的另一实施方案包括下列步骤：将含 有PAMG-1的液体样品添加至多孔材料的可移动标记抗体区，该区域允许抗体和蛋白质穿 过其而迀移，该抗体区包括对PAMG-1有高特异性的可移动的抗体，导致抗体向PAMG-1的附 着，从而形成抗体-PAMG-1复合物；复合物向其中含有固定化的二抗的试验区迀移，二抗具 有对PAMG-1的结合亲和力，导致二抗结合至标记抗体-PAMG-1复合物，从而形成固定化的 复合物；并检测试验区中固定化的复合物。
[0127] 而本方法的另一实施方案为标准夹心测定，其中未标记的抗体固定于任何表面 上。含PAMG-1的液体样品的添加导致PAMG-1被固定化的抗体结合，从而形成抗体-PAMG-1 复合物。标记的抗体的添加导致包含固定化抗体和PAMG-1-标记抗体的复合物的形成，以 及该复合物的检测。
[0128] 根据上述方法，抗体可包括可检测标志或标记，检测抗体-PAMG-1或PAMG-1-抗体 复合物的步骤包括所述可检测标志或标记的检测。可用的可检测标志的实例包括染色颗 粒、酶、染料和放射性同位素。在具体的实施方案中，可检测标记为金的染色颗粒，例如具有 在约20nm和30nm之间的平均尺寸。还在另一实施方案中，可检测标志为辣根过氧化物酶。
[0129] 检测PAMG-1的示例件装詈
[0130] 预想多种装置供检测样品中的PAMG-1蛋白。根据本
【发明内容】
的装置和/或方法优 选可检测 PAMG-1 浓度在约 lng/ml 和 50 y g/ml、约 2ng/ml 和 50 y g/ml、约 3ng/ml 和 50 y g/ ml或约4ng/ml和50 y g/ml之间的样品中的PAMG-1。可用于本文所公开方法的装置的非 限制性实例记述于Fuks等人的美国专利7, 709, 272号。供本方法使用的装置也包括，例 如，一种盒，其包含试验条（例如，具有放置样品的衬垫区和读取结果的试验区），以及任选 地包括内置计时器和/或指示患者身份的部位。衬垫和试验区在下文更详细地讨论。在本 方法的某些实施方案中，优选的PAMG-1检测阈值调节为至少约4ng/ml。应理解本
【发明内容】
的方法和装置也涵盖约至少lng/ml、约至少2ng/ml和约至少3ng/ml的PAMG-1检测阈值。
[0131] 可使本文记述的装置和方法适合易于以快速方便的方式使用，从而使得装置和方 法可用于门诊患者情况。例如，该方法可并入可由对装置几乎或完全没有在先经验的患者 操作的易用装置中。这使得方法和装置高度可靠，并且不太受操作错误影响。也可设计该 方法，使之能够以简单的"是"或"否"（或者" + "或确定样品（例如阴道液样品）中 PAMG-1的存在。
[0132] 检测PAMG-1的示例性非限制装置在图1和2中示出。为举例的目的，该记述涉及 下文举例的单克隆抗体。然而，这些特异性单克隆抗体的使用并非必需。例如选择如上文 所记述的成对PAMG-1特异性抗体的步骤可由本领域普通技术人员重现。
[0133] 如图1和2所示，可用于实施本文所公开方法的示例性装置具有包含数个依次互 相连接的元件的条状主体。更具体地，装置的部件12包括衬垫，该衬垫包含M271抗体区 10,该区域中的M271抗体是由例如染色颗粒SP (图中未示出）标记的。衬垫12可由玻璃 纤维薄纸（fiberglass tissue)或任何其它材料制成，这些材料是多空的，并允许样品的各 种颗粒和物质迀移。染色颗粒可包括平均尺寸在20至30nm范围内的金颗粒。M271抗体区 也含有由相同染色颗粒标记的小鼠IgG免疫球蛋白。通过用标记的M271抗体和标记的小 鼠IgG溶液浸渍衬垫12,将标记的M271抗体和小鼠IgG免疫球蛋白引入衬垫12的条带部 分10。可用画笔或微滴形成装置将M271抗体和小鼠IgG免疫球蛋白溶液引入硝化纤维素 膜22。纵向连接至衬垫12 -端的是[a]硝化纤维素膜22,其包哈试验区14和对照区16。 试验区14和对照区16都横向地设置在装置的整个宽度上。试验区14为硝化纤维素膜22 的条带部分。试验区14含有附着至硝化纤维素膜22的M52抗体。对照区16含有附着至 硝化纤维素膜22的抗小鼠抗免疫球蛋白抗体。对照区16跨越条22的整个宽度。滤纸膜 24连接至硝化纤维素膜22的末端，该末端与硝化纤维素膜22连接至衬垫12的末端相对。 滤纸膜24与硝化纤维素条22末端纵向连接。装置的表面覆以特别的保护膜28和30,例如 为条形装置特别设计的薄粘合带。箭头18画在膜28表面，用以显示衬垫12的样品施加末 端。衬垫12、硝化纤维素膜22和滤纸条24附着至粘性硬塑料基材26。
[0134] 在本部分记述的实施方案中，装置包括由允许抗体和蛋白质从中迀移的多孔样品 施加基质形成的M271抗体衬垫区10。M271抗体区10包括能够高度特异结合至PAMG-1的 M271抗体。将含有PAMG-1的液体样品引入M271抗体区导致M271抗体附着至PAMG-1，从 而形成抗体M271 -PAMG-1复合物。装置也包括试验区14,其与由允许抗体和蛋白质从中迀 移的多孔材料所形成的M271抗体区10在液体中相连。试验区14包括固定化于试验区14 中、也能够结合至PAMG-1的M52抗体。M52抗体免疫地区别于M271抗体，使得M271和M52 抗体可同时结合至PAMG-1。液体样品引至M271抗体区10,导致抗体M271 -PAMG-1复合物 迀移入试验区14,在此处抗体M271 - PAMG-1复合物通过M52抗体而结合至固定化于试验区 中的M52抗体。该装置基于固定在试验区14中的M52抗体的存在而检测样品中的PAMG-1。 结果，仅PAMG-1形成固定于试验区14中的抗体M271 - PAMG-1 - M52抗体复合物。于是，固 定于试验区14中的M52的存在能指示样品中PAMG-1的存在。
[0135] 在检测阴道分泌物中PAMG-1的装置的实施方案中，M271抗体附着有可检测标志， 其用于检测固定于试验区14的PAMG-1。可用的可检测标志的实例包括但不限于，染色颗 粒、酶、染料、荧光染料和放射性同位素。在某一实施方案中，可检测标志为平均尺寸在约 20-30nm之间的金颗粒。在某一实施方案中，M271抗体为冻干状态的标记的抗体。
[0136] 在M271抗体衬垫区中的M271抗体由可检测标志标记的多个实施方案中，装置进 一步包括含有M52抗体的试验区。衬垫区和试验区在液体中相连。
[0137] 还在装置的另一实施方案中，也表现为图1和2说明的装置范围内，装置具有具备 近端和远端的条状主体。条状主体的M271抗体区10由允许抗体和蛋白质从中迀移的材料 制成。条状主体的M271抗体区10包括对PAMG-1有高度特异结合亲和力的M271抗体，包 含PAMG-1的液体样品向M271抗体衬垫区的引入导致M271抗体向PAMG-1附着，从而形成 抗体M271 - PAMG-1复合物。
[0138] 条状主体也包括试验区14,其接近于M271抗体区10,并与M271抗体区10在液体 中相连。试验区14由允许抗体和蛋白质从中迀移的材料形成。试验区14包括固定于试验 区14中的、具有对PAMG-1的结合亲和力的M52抗体，液体样品向M271抗体区10的引入导 致抗体M271 - PA