Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)。
[0079] 识别相同或重叠表位的抗体可在显示某一抗体阻断另一抗体向靶抗原结合的能 力的简单免疫测定，例如竞争性结合测定中鉴别。竞争性结合在试验结合分子抑制参比 结合分子与共同抗原例如PAMG-1的特定结合的测定中确定。已知多种类型的竞争性结 合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定（RIA);固相直接或间接酶免疫测定（EIA) 夹心竞争测定（见Stahli等人，Methods in Enzymology 9:242(1983));固相直接生物 素-亲和素EIA(见Kirkland等人，J. Immunol. 137:3614(1986));固相直接标记测定， 固相直接标记夹心测定（见 Harlow 和 Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988));用 1-125 标记的固相直接标记 RIA (见 Morel 等人， Mol. Immunol. 25 (1) : 7 (1988));固相直接生物素-亲和素 EIA (Cheung 等人，Virology 176:546 (1990));和直接标记 RIA (Moldenhauer 等人，Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))。
[0080] 通常，此类测定包括使用纯化的抗原，该抗原结合至固体表面或带有未标记试验 结合分子和标记的参比结合分子之一的细胞。竞争性抑制通过确定在试验结合分子存在下 结合至固体表面或细胞的标记的量来测定。通常试验结合分子过量存在。通常，当竞争性 结合分子过量存在时，其将会以至少50-55 %、55-60 %、60-65 %、65-70 %、70-75 %或更高 的水平抑制参比结合分子与共同抗原的特异性结合。
[0081] 现有技术中已知的多种方法可用于生产对PAMG-1多肽或其衍生物或类似物的 多克隆抗体。对于抗体的生产，可通过注射PAMG-1多肽或其衍生物（例如片段或融合蛋 白）来免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在某一实施方案 中，PAMG-1多肽或其片段可缀合至致免疫载体，例如牛血清白蛋白（BSA)或匙孔血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin，KLH)。取决于宿主物种，可使用各种佐剂来增加免疫应答， 包括但不限于弗氏佐剂（完全和不完全），矿物凝胶例如氢氧化铝，表面活性物质例如溶血 卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基酚以及潜在有用的 人类佐剂例如BCG(卡介苗）和短小棒状杆菌（Corynebacteriumparvum)。
[0082] 关于指向PAMG-1多肽或其片段、类似物或衍生物的单克隆抗体的制备，可使用 任何通过培养中的传代细胞系而提供抗体分子产生的任何技术。这包括但不限于最初由 Kohler和Milstein(Nature 1975,256:495-497)发展的杂交瘤技术，以及三体瘤（trioma) 技术、人B细胞杂交瘤技术（Kozbor等人，Immunology Today 1983,4:72;Cote等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1983, 80:2026-2030)，和 EBV-杂交瘤技术来生产人单克隆抗 体（Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , 77-96 页，1985)。在本
【发明内容】
的附加的实施方案中，单克隆抗体可在无菌动物中生产（国际专 利公布号W0 89/12690,1989年12月28日公布）。事实上，根据本
【发明内容】
，可使用通过将 来自对PAMG-1多肽特异的小鼠抗体分子的基因和来自有适当生物活性的人类抗体分子的 基因共同剪接而发展的用于产生"嵌合抗体"(Morrison等人，J.Bacteriol. 1984, 159:870 ; Neuberger 等人，Nature 1984, 312:604-608 ;Takeda 等人，1985, Nature 314:452-454)的 技术；此类抗体在本
【发明内容】
的范围之内。优选此类人或人源化嵌合抗体用于人类疾病或 病症（下文记载）的治疗，鉴于人或人源化抗体比异种抗体更不可能诱导免疫应答，特别是 变态反应应答自身。
[0083] 根据本
【发明内容】
，记载用于生产单链抗体的技术（Huston的美国专利5, 476, 786 和5, 132, 405号；美国专利4, 946, 778)可修改来生产PAMG-1多肽特异性单链抗体。实际 上也可传递这些基因供体内表达。本
【发明内容】
的附加实施方案利用记载用于Fab表达文库 构建的技术（Huse等人，Science 1989,246:1275-1281)来实现迅速并容易地鉴别具有对 期望的PAMG-1多肽或其衍生物或类似物的特异性的单克隆Fab片段。
[0084] 包含抗体分子独特型的抗体片段可通过已知技术产生。例如，此类片段包括但不 限于：可通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab) 2片段；可通过还原F(ab) 2片段的二 硫键而产生的Fab片段，和可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段。
[0085] 在抗体的生产中，对期望的抗体的筛选可通过现有技术中已知的技术来完成，例 如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定）、"夹心"免疫测定、免疫放射分析、凝胶扩 散沉淀素反应、免疫扩散分析、原位免疫测定（例如使用胶态金、酶或放射性同位素标记）、 免疫印迹法、沉淀反应、凝集测定（例如凝胶凝集测定、血细胞凝集测定）、补体固定测定 (complement fixation assays)、免疫焚光测定、蛋白A测定和免疫电泳测定等。在某一实 施方案中，抗体的结合通过检测一抗上的标记来检测。在另一实施方案中，一抗通过检测二 抗或对一抗的试剂来检测。在进一步的实施方案中，二抗是标记的。用于在免疫测定中检 测结合的很多手段在现有技术中是已知的，并且在本
【发明内容】
的范围之内。例如，为了选择 识别PAMG-1多肽特定表位的抗体，对产生的杂交瘤可测定其结合至含有该表位的PAMG-1 多肽片段的产物。关于对来自特定动物物种的PAMG-1多肽有特异性的抗体的选择，可根据 与该动物物种细胞表达或分离的PAMG-1多肽的阳性结合来进行选择。
[0086] 在本文公开的某些方面，本文公开的PAMG-1-特异性单克隆抗体可为例如杂交瘤 N271产生的M271，由俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)保藏机构保藏并分配登录号 VKPM-93 ;杂交瘤N52产生的M52,由VKPM保藏并分配登录号VKPM-92 ;和杂交瘤N42产生 的M42,由VKPM保藏并分配登录号VKPM-94。所述PAMG-1特异性单克隆抗体的结合性质和 其它特征在Fuks等人的美国专利7, 709, 272号中详细公开。产生例如PAMG-1特异性抗体 的杂交瘤细胞系，例如上文所公开的，可通过下列过程产生。首先，用PAMG-1免疫具有脾和 淋巴结B细胞的小鼠。然后产生杂交瘤来使B细胞永生化。B细胞可以是脾和/或淋巴结 B细胞。然后，产生对PAMG-1有结合亲和力的单克隆抗体的杂交瘤在ELISA中鉴别：第一 层：PAMG-1 ;第二层：杂交瘤上清液；和第三层：辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠抗体的缀 合物。然后在体外或腹水中培养这些鉴别出的杂交瘤，并分离它们产生的单克隆抗体。
[0087] 如本文所公开的，可组合使用两种或更多种PAMG-1特异性抗体（例如单克隆抗 体）来检测阴道液样品中的PAMG-1。在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的至少一 种抗体被可检测地标记。可使用各种可检测标志，包括但不限于染色颗粒、酶、荧光染料和 放射性同位素。可检测标志的一个特定实例为平均尺寸在20至30nm范围内的金染色颗粒。 可检测标志的另一实例为辣根过氧化物酶。将可检测标志附着至抗体的方法记载于例如 Harlow, E?和 Lane, D?的 Methods In Enzymology, 1981，Vol. 73, 3-46 页；"Antibodies a Laboratory Manual, "Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 322, 323和 343 页；和Pierce 产品目录，T9-T17页（1996)。合适的酶包括但不限于碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。根 据本
【发明内容】
使用的其它标志或标记包括胶态金、有色胶乳珠、磁珠、荧光标记（对荧光团 仅举几例，如异硫氰酸荧光素（FITC)、藻红蛋白（PE)、德克萨斯红（TR)、罗丹明、游离或螯 合的镧系盐特别是Eu3+)或磁共振成像标记。其它标志包括例如用于均相和固相测定的荧 光猝灭和焚光转移标记。此外，根据本
【发明内容】
，标志可为供与另一分子例如生物素-链霉 亲和素、谷胱甘肽-GST、六聚组氨酸（hexahistidine)-镍等相互作用的表位、结合配偶体 (binding partner)或"把手（handle)"。本
【发明内容】
也考虑使用自身被可检测地标记的二 抗作为标志（例如，在成对的抗PAMG-1抗体使用具有来自两种不同动物物种的Fc部分的 抗体的情况中）。
[0088] 本文公开的抗体可以是可移动的（例如，能够在引进液体样品时移动（例如在流 动装置中））和/或固定化的（例如在条形装置的试验区中）。使样品固定化的方法在现有 技术中是公知的。
[0089]PAMG-1 的检测
[0090] 免疫测定，特别是免疫色谱测定，包括根据本
【发明内容】
的优选的技术，且免疫测定 在下文详细阐述。这些测定具有特异性、准确性、速度和经济的优点。但也可使用其它检测 和定量PAMG-1的方法。此类技术的一种是质谱法，例如，使用利用飞行时间室中的延迟引 出（delayed extraction)和反射器（reflectron)的基质辅助激光解吸电离（MALDI)飞行 时间（T0F)质谱（MS)。优选地，MALDI测定在硅阵列上进行。MALDI用的阵列的实例为氧化硅 上350 ym中心的200 ym圆形胶垫。胶垫之间的疏水表面（防水表面）为MALDI进一步提供 更集中的基质/蛋白质点，因而改善定量的信号。例如，用Packard Bioscience系统产生的 点，其直径可小于200 ym。Piezo系统可将约300pL MALDI基质（例如DHB、芥子酸）传递至 亲和捕捉剂-肽点的确切位置，从而创造均相的肽/基质晶体。MALDI-MS (例如Pers印tive Voyager)中从该晶体的脱附 / 电离（Karas 等人，Ion Processes, 1987, v. 78, 53-68 页，或 Zenobi等人，Mass Spectrom. Rev. 1998, v. 17, 337-366页）产生肽峰高度与含有该肽的蛋 白质的量相关的质谱。
[0091] 用于本文公开的方法的可选的技术为毛细管电泳色谱，其可允许定量存在于少量 样品中的分析物。
[0092] 此外，可单独或组合使用定量生物化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相 色谱等，来检测和定量样品中PAMG-1的量。
[0093] 本文公开的方法所涵盖的此类使用示例性PAMG-1特异性抗体的免疫测定详细记 载于Fuks等人的美国专利7, 709, 272号。
[0094] 检测PAMG-1的免痔免痔方法和装詈
[0095] 现有技术中已知的多种用于检测抗体对抗原免疫特异性结合的方法可用于依照 本
【发明内容】
检测结合。涉及复合物分析的检测抗原和抗体之间相互作用的早期方法是通过 凝胶中的沉淀。检测分析物-检测抗体结合对的进一步的方法包括使用放射性碘标记的检 测抗体，或者放射性碘标记的、可与IgG反应的蛋白质，例如蛋白A。这些早期方法是本领域 技术人员公知的，如在Methods in Enzymology, 1980, v. 70, 166-198页中综述的。通过选 择获得高于本文公开的PR0M阈值的阳性结果的抗体和条件，可在本文公开方法的实践中 使用此技术。
[0096] 仅用一种抗体确定样品中分析物的存在的后期方法包括竞争性结合测定。在此 技术中，通常固定化于固体载体上的抗体将与已知量的标记的分析物一起，暴露于怀疑含 有分析物的样品。然后，这两类分析物，即标记的分析物和样品中的分析物，将竞争抗体上 的结合位点。确定游离的标记的分析物或结合的标记的分析物，并从该测定中得出样品中 竞争性分析物的量。此方法更完整的记述在〃Basic Principles of Antigen-Antibody Reaction〃，Elvin A. Labat, (Methods in Enzymology, 70, 3-70, 1980)中公开。在此实例 中，标记的分析物可用放射性同位素或酶标来标记。
[0097] 更近期的免疫测定利用双抗体法来检测分析物的存在。这些技术也在上文引用的 Methods in Enzymology卷中综述。因此，根据本
【发明内容】
的一个实施方案，利用对各个欲 检测标志的成对抗体来确定个别标志的存在。所述成对抗体的抗体之一在本文中称为"检 测抗体"，而所述成对抗体中的另一抗体在本文中称为"捕捉抗体"。本
【发明内容】
的某一实施 方案于是使用双抗体夹心法来检测阴道液样品中的PAMG-1。在此方法中，分析物夹在检测 抗体和捕捉抗体之间，捕捉抗体不可逆地固定化于固体载体上。检测抗体会含有可检测的 标记，用来鉴别抗体-分析物夹层的存在，并由此鉴别分析物的存在。
[0098] -般早期的固体载体形式包括聚苯乙烯板、管或珠，它们在放射免疫测定和酶免 疫测定领域中均是已知的。最近以来，若干多孔材料例如尼龙、硝化纤维素、醋酸纤维素、玻 璃纤维和其它多孔聚合物已用作固体载体。
[0099] 因而，在具体的实施方案中，本发明的装置包含用于进行免疫色谱测定的部件 ("免疫色谱测定装置")。此类装置包含用于引导液体的固相部件。如在本文中使用，术语 "用于引导液体的固相部件"是指允许液体从中迀移（例如通过毛细作用）的固体载体。具 有该性质的代表性产品是硝化纤维素膜，其可通过本领域技术人员公知的方法来制备。 [0100] 很多免疫色谱测定方法和形式是现有技术中已知的，并可用于本文所公开方法的 实践中。用膜作为浸渍片或流通（flow-through)装置中的固体载体的免疫色谱测定已良 好建立，供临床实验室使用，以及可选地供例如非实验室现场试验。免疫色谱测定装置的 通常外观为包在塑料保持件中的膜（纤维素或非纤维素）。塑料保持件使膜保持适当的构 造，从而确保整个装置的正确运行。测定装置的基本结构有很多变化形式。例如，Litman 等人（美国专利号5, 156, 952和5, 030, 558)记述了用于确定样品中最小量分析物存在的 测定方法和装置。Ullman等人（美国专利号5, 137, 808和4, 857, 453)记述了一种安置 测定膜的装置，其包括用来辅助样品流动的自包含液体试剂。Dafforn等人（美国专利号 4, 981，768)记述了一种具有供施加样品和额外液体用的接口的装置。Corti等人（欧洲专 利申请号89118378. 2)、Greenquist等人（美国专利号4, 806, 312)和Berger等人（美国 专利号5, 114, 673)也记述了测定装置。
[0101] 优选地，免疫色谱测定部件包括对照，来指示测定已正确地进行。对照可以是在固 相载体上处于比检测区更远离样品施加点的位置的特异结合反应物，其将在分析物存在或 不存在时向标记试剂结合，于是指示可移动的受体已随同液体样品迀移了足够的距离，从 而给出有意义的结果。
[0102] 供免疫色谱测定中使用的合适的标记包括酶、荧光团、生色团、放射性同位素、染 料、胶态金、胶态炭、胶乳颗粒和化学发光剂。当使用对照标志时，对于受体和对照标志可使 用相同或不同的标记。
[0103] 本
【发明内容】
的某一实施方案使用流通型免疫测定装置。Valkirs等人（美国专利 号4, 632, 901)公开了一种装置，其包括对抗原分析物特异、结合至添加液体样品的多孔膜 或滤器的抗体。液体流过膜时，靶分析物结合至抗体。添加样品之后，接着添加标记的抗体。 对标记抗体的目视检测提供样品中靶分析物存在的指示。
[0104] 流通装置的另一实例由Kromer等人（EP-A 0 229 359)公开，其记述了一种试剂 运送系统，包含由分散在水溶性聚合物中的试剂或其组分饱和的基质，用于控制供运送至 处于基质之下的反应基质的试剂的溶解速率。
[0105] 在迀移型测定中，固相载体例如膜由进行测定所需的试剂浸渗。提供结合标记的 分析物并读出测定结果的分析物检测区。例如，见Tom等人（美国专利号4, 366,241)和 Zuk(EP-A 0 143 574)。迀移测定装置当中通常掺入已附着至例如胶态金或炭等有色标记 的试剂，从而实现无需添加另外的物质就可视检测测定结果。见例如Bernstein (美国专利 号 4,770,853)、]\&^等人（10 88/08534)和〇111^等人伍?-六 0 299 428)。所有这些已知 类型的流通装置可根据本文公开的方法来使用。
[0106] 直接标记是可用于根据本
【发明内容】
的免疫色谱测定的标记的一个实例。直接标记 已定义为在天然状态下对裸眼轻易可见，或借助于滤光片和/或施加例如u. V.光等激发来 促进荧光从而可见的实体。可根据本
【发明内容】
使用的有色标记的实例包括金属溶胶颗粒， 举例来说，金溶胶颗粒，例如Leuvering (美国专利号4, 313, 734)所记述的；染料溶胶颗粒， 例如Gribnau等人（美国专利号4, 373, 932)和May等人（W0 88/08534)所描述的；染色的 胶乳，例如May(见上文），Snyder(EP-A 0 280 559和0 281 327)所记述的；或如Campbell 等人（美国专利号4, 703, 017)记述的包封在脂质体中的染料。其它直接标记包括放射性 核素、荧光部分或发光部分。除这些直接标记装置以外，包含酶的间接标记也可根据本发明 内容使用。各种类型的酶联免疫测定在现有技术中是公知的，例如碱性磷酸酶和辣根过氧 化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、脲酶这些以及其它已由Eva Engval 1 在Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT, Methods in Enzymology, 70. 419-439, 1980 和美 国专利号4, 857, 453中详细讨论。
[0107] 在具体的实施方案中，本
【发明内容】
的诊断装置包含具有接近于样品引入点的检测 部和该位置下游的捕捉部的膜组件。检测部含有将与样品中存在的本
【发明内容】
的任何分析 物反应的抗体（检测抗体）（例如单克隆抗体）。检测抗体可逆地固定在膜上，并且在使用 时会随样品一起迀移。虽然并非不可或缺，但优选检测抗体以例如放射性核素、酶、荧光部 分、发光部分或如现有技术中所记述及上文所讨论的有色标记等来