检测牛奶中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于畜产品药物残留免疫分析技术领域，具体涉及一种快速检测检测牛奶 中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条。
【背景技术】
[0002] 地塞米松是临床上常用的糖皮质激素类药物之一，常配合其他药物一起使用，具 有抗炎、抗毒、抗过敏的作用，还可以提高饲料转化率，从而增加动物体重。由于该类药物不 合理使用可能导致动物源性食品中糖皮质激素的残留，构成了对人类健康的潜在危害。
[0003] 通过研究表明，如果过多吃进糖皮质激素类药物，可引起物质代谢和水盐代谢紊 乱，出现类肾上腺皮质功能亢进综合征，诱发白内障，骨质酥松及心血管系统并发症。因此， 我国和欧盟等都规定了牛奶中地塞米松最大残留限量为0. 3 μ g/kg。
[0004] 为了保障我国出口动物源食品的安全和人民的健康，对该类药物的检测势在必 行。Roberts和Jackson(1995)报道了用ELISA法检测马尿中的地塞米松残留。Meyer等 (1996)报道了用ELISA法检测动物尿样，从而筛选有合成类糖皮质激素类残留的动物源食 品的方法，其最低检测限I. 45ng/ml。目前该类药物的ELISA方法主要存在的问题就是灵敏 度达不到残留检测的要求，而本发明公开的检测牛奶中地塞米松残留的胶体金试纸条，直 接检测牛奶，并进行了后期的方法评价，结果表明该试纸条的性能可以达到检测要求，可直 接应用于现场检测和大量样品的初筛。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种检测牛奶中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条。
[0006] 本发明是基于制备得到一种能够识别地塞米松的单克隆抗体（该单克隆抗 体是由杂交瘤细胞SC20150701D分泌的，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞 SC20150701D，于2015年7月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保 藏，保藏号为CCTCC NO :C 2015130)，通过制备胶体金，标记纯化后的抗体，优化各项层析条 件等完成的。
[0007] 上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种检测牛奶中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条，包括吸收垫、硝酸纤维 素膜、金标垫和样品垫；在所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线；所述的吸收垫、硝酸 纤维素膜、金标垫、样品垫依次粘贴在塑料衬板上。所述金标垫包被有胶体金标记的能识 别地塞米松的单克隆抗体，所述检测线包被有地塞米松包被原，所述质控线包被有羊抗鼠 IgG0
[0009] 所述的能识别地塞米松的单克隆抗体是由杂交瘤细胞SC20150701D所分泌的，该 杂交瘤细胞SC20150701D于2015年7月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO :C2015130。
[0010] 所述的地塞米松包被原是由地塞米松与牛血清白蛋白形成的偶联物。
[0011] 申请人提供了一种检测牛奶中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条的制备方 法，包括牛奶脱脂的前处理和用胶体金试纸条进行检测的步骤。
[0012] 具体步骤如下：
[0013] (1)复苏保藏号为CCTCC NO :C2015130的杂交瘤细胞SC20150701D并免疫小鼠， 制备得到单克隆抗体，并利用辛酸硫酸铵法进行纯化。
[0014] (2)利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；同时优化标记条件；制备出能识别地塞 米松的金标抗体；
[0015] (3)将地塞米松包被原和羊抗鼠 IgG包被原包被在硝酸纤维素膜上；
[0016] (4)将牛奶样品脱脂后，利用本发明制备的胶体金免疫层析试纸条进行检测。
[0017] 检测牛奶中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条的使用方法优选的技术方案 为：在牛奶样品检测之前用4000r/min离心5min脱脂，完成前处理，有利于牛奶中地塞米松 残留检测的准确性。检测时，若样品中含有地塞米松，则药物地塞米松先和胶体金标记的单 克隆抗体结合，到达检测线时，已结合了地塞米松的胶体金标记的单克隆抗体就不会与包 被在硝酸纤维素膜上的包被原发生结合，即不会在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线， 该结果判定为阳性结果。若样品中不含有地塞米松，检测时胶体金标记的单克隆抗体就会 与包被在硝酸纤维素膜上的包被原发生结合，即在检测线处形成肉眼可见的红色沉淀线， 未反应的胶体金标记的抗体继续向前泳动，富集在质控线上，形成红色沉淀线，该结果判定 为阴性结果。
[0018] 保藏号为CCTCC NO :C2015130的杂交瘤细胞SC20150701D可在制备识别地塞米松 的单克隆抗体中应用。
[0019] 由保藏号为CCTCC NO :C2015130的杂交瘤细胞SC20150701D分泌的单克隆抗体可 在制备检测牛奶中地塞米松残留的胶体金免疫层析试纸条中应用。
[0020] 本发明的胶体金免疫层析试纸条可在牛奶中地塞米松残留检测中的应用。
[0021] 本发明的突出效果在于建立了一种牛奶中地塞米松残留检测的快速方法。本发明 的胶体金免疫层析试纸条灵敏度高，样品可直接检测，比传统ELISA方法更快速、高效、简 便和易于操作。
[0022] 更详细的技术方案和效果请参见《【具体实施方式】》。
【附图说明】
[0023] 图1 :是本发明的操作步骤示意图。附图标记说明：图中：依次为：1_准备好牛奶 样本予以编号，并恢复至室温；2-从原包装中取出试剂桶，打开后取出所需数量的微孔试 剂盒试纸条，做好标记，并及时盖好盖子防止受潮；3-吸取待测牛奶样本溶液200 μ L于微 孔中；4-缓慢抽吸5次且充分与微孔中试剂混匀，反应5min ;5_将标记好的试纸条插入微 孔中，印有"MAX"线端朝下，使之充分浸入溶液中，室温孵育5min ;6_取出试纸条，根据示意 图判定结果。
[0024] 图2 :是本发明的胶体金免疫层析试纸条的结构示意图。附图标记说明：图中：依 次为：7_吸收垫；8-硝酸纤维素膜；9-金标垫；10-样品垫；11-检测线；12-质控线；13-塑 料衬板（或称为PVC塑料衬板），14-标示层析液流动方向。
[0025] 图3 :是本发明胶体金免疫层析试纸条的显色判定示意图。附图标记说明：图中： 依次为：
[0026] a-试纸条判定线示意图，其中：
[0027] 15-手持端，16-C线，17-T线，18-MAX线；b-阴性（表示牛奶样品中地塞米松药物 浓度低于试纸条的检测限）；c-阳性（T线显色比C线弱或者显色与C线相同，均表示牛奶 样品中地塞米松药物浓度等于或高于试纸条的检测限，d、e同理）；d_阳性；e-阳性；f-无 效（未出现C线，说明试纸条失效或者没有完全反应，g同理）；g-无效。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不是限制本发明。
[0029] 实施例1胶体金免疫层析试纸条的制备
[0030] I. 1单克隆抗体的制备与纯化
[0031] I. I. 1细胞融合与筛选：在融合前3天给免疫合格的小鼠强化免疫。根据骨髓瘤 细胞的计数结果，取骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合；以1500r/min离心5min，将离心管上清 倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴；将吸有ImL预温至37°C的50%聚乙二醇（PEG)的ImL 刻度吸管插入到管底，缓缓加 PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置9〇sec，用预 温至37°C的RPMI - 1640基础培养液（购于Hyclone公司）沿管壁缓缓加到融合细胞上， 边加边轻轻晃动离心管，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀；以1500r/min离心5min，弃 去上清，用含有饲养细胞的HAT完全培养基（购于Hyclone公司）轻轻将融合细胞搅拌重 悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，置于CO 2培养箱中培养。根据细胞的生长 情况，取细胞培养上清，利用ELISA方法筛选出分泌地塞米松抗体的阳性细胞孔。对筛选出 来的阳性细胞孔利用有限稀释法克隆化，最终建立得到一株稳定的分泌且能够识别地塞米 松的单克隆抗体的杂交瘤细胞，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞SC20150701D， 于2015年7月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏， 保藏号为 CCTCC NO :C2015130。
[0032] I. 1. 2腹水的制备：用RPMI 1640基础培养基（购于Hyclone公司）悬浮培养由 保藏号为CCTCC NO: C 2015130的杂交瘤细胞SC20150701D扩大培养的细胞，在接种前7天 取Balb/c小鼠（购自湖北省疾病预防控制中心）4只，每只小鼠腹腔注射0. 5mL弗氏不完 全佐剂进行预处理，待小鼠腹腔明显膨大时采集腹水，收集的腹水在5000r/min离心5min 后，去掉表面油层，小心吸取上清，分装后置-20°C保存备用。
[0033] I. 1. 3单克隆抗体的纯化：取预处理过的腹水10mL，加入20mL 0. 06M pH 4. 0醋酸 缓冲液（量取I. 155mL醋酸定容至IOOmL为A液，称取27. 22g三水合醋酸钠定容至IOOmL为 B液，取A液82mL和B液18mL混合配制而成），调节pH至4. 5,于室温搅拌下逐滴缓慢加入 正辛酸330 μ L后，继续搅拌30min，4°C静置2h ;4°C，12000r/min离心30min，取上清；接着 往上清液中加入适量的0.0 lM pH 7. 4磷酸盐缓冲液（PBS上清液和PBS的体积比为10:1); 于冰浴搅拌条件下逐滴加入的饱和硫酸铵，使其最终浓饱和度为45%，4°C静置2h ;4°C， 12000r/min