检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体的说是涉及一种能够准确、快速、便捷地检测 恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法。
【背景技术】
[0002] 恩诺沙星（Enrofloxacin)，简写为Enro,又名恩氟奎林羧酸，属于氟奎诺酮类 (Fluoroquinolones)之化学合成抑菌剂，易溶于甲醇及氰甲烧等有机溶剂，是一类人畜通 用的药物，因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等 特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖 中用于疾病防治。恩诺沙星近年来在食用动物饲养中的滥用越来越受到人们的重视，由于 恩诺沙星药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织后就在人体内残留蓄积，造成人 体疾病对该药物的严重耐药性，影响人体疾病的治疗。联合国粮农组织/世界卫生组织食 品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了恩诺沙星药物在动物组织中的最高残留限量。 美国FDA于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。
[0003] 分析检测领域的研究者一直致力于研究开发恩诺沙星残留的快速、可靠、低成本 的检测方法。目前检测恩诺沙星药物残留的方法有LC-UV、LC-MS、LC-MS-MS和LC-E頂S等， 该类技术需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用 高，难以满足高流通量、快速检测的需要。ELISA等免疫分析具有样品处理简单、特异性高、 成本低和操作简单等优点，但也存在假阳性高、重复性差、酶易失去活性等缺点。
[0004] 时间分辨荧光免疫层析方法是一种快速有效的兽药残留分析方法，该方法具有操 作简单、快速，高效、高灵敏度，不需要专业人员操作，成本低、易推广等优点。因此在食品安 全这个全球关注的热点问题中，为了快速准确地检测各种违禁兽药的残留，建立特异、灵敏 和快速的分析方法已经成为科研工作者的一项紧急任务。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制 备方法，以解决检测食用动物体内恩诺沙星残留样品处理复杂，检测设备昂贵的问题。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案为： 一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，它包括以下步骤： 步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将恩诺 沙星、N-羟基琥珀酰亚胺，以及碳二亚胺盐酸充分溶解于二甲基甲酰胺中，于室温下搅拌 20~28h，即可得到恩诺沙星反应液，称取相应分量的牛血清白蛋白，使之充分溶解在pH=7. 2 的磷酸盐缓冲液中，将恩诺沙星反应液逐滴缓慢滴加到该牛血清白蛋白溶液中，并于室温 下搅拌2~4h，然后用磷酸盐缓冲液透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物 质；将溶液以20000r/min离心30min，收集上清，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色 粉末； 步骤二、抗恩诺沙星克隆抗体的制备：用步骤一所制备的恩诺沙星药物人工抗原偶联 物免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫三次后，分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀衆制备免疫 脾细胞，再将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的抗体亚型为IgG ;采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进 行纯化后免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠 IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉 淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠 IgG ; 步骤三、时间分辨荧光的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备出粒直径为16~18nm的时 间分辨焚光Eu3+; 步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：用步骤三制备的时间分辨荧光Eu3+作为标记物标 记恩诺沙星单克隆抗体，试验选择出最佳标记的pH值为6. 0,最佳标记量为lmL，时间分辨 荧光Eu3+标记恩诺沙星单克隆抗体为32. 5 μ g，制备出经过时间分辨荧光Eu 3+标记后的恩 诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光； 步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星人工抗 原包被在检测线T线处，兔抗鼠 IgG多克隆抗体包被在质控线C线处，免疫时间分辨荧光包 被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度 为0. 9~1. 1_，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时 间分辨焚光免疫分析试纸； 作为本发明的进一步改进，所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸100% 抑制浓度为500ng/mL。
[0007] 作为本发明的更进一步改进，所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试 纸包括卡套、试纸条，试纸条包括依次重叠粘贴在PVC底板上的吸水垫、NC膜、金标垫、样品 垫，NC膜上设有两条包被线，一条线包被着所述步骤二所制备的抗恩诺沙星克隆抗体兔抗 鼠 IgG作为质控线C线，另一条线包被着所述步骤一制得的恩诺沙星药物人工抗原作为检 测线T线；金标垫上包被有步骤四所制备的经过超低温冷冻干燥固化后的免疫时间分辨荧 光作为示踪物。
[0008] 作为本发明的更进一步改进，所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试 纸的卡套的外壁上设有观察孔、点样孔，观察孔位于所述质控线C线和检测线T线的上方。
[0009] 作为本发明的更进一步改进，所述NC膜型号为Millipore 135。
[0010] 本发明采用时间分辨荧光免疫分析试纸分析方法来检测动物组织中恩诺沙星的 残留，它包括特异性单克隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到 分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用 Protein G柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体IgG ;恩诺沙星残留快速检测试纸条 的制备及组装。
[0011] 本发明检测的基础是标记免疫反应，以分辨荧光Eu3+标记的恩诺沙星单克隆抗体 作为示踪物，以恩诺沙星人工合成抗原包被在T线上作为恩诺沙星的竞争物，通过免疫层 析过程选择中最佳条件的筛选，成功建立了恩诺沙星兽药残留的时间分辨荧光免疫层析试 纸条快速检测方法，该方法能够对恩诺沙星残留进行定性检测。恩诺沙星残留的时间分辨 荧光免疫层析试纸条100%抑制为500 ng/mL，对其它恩诺沙星结构类似物的兽药没有明显 的交叉反应。样品添加回收试验表明，可以用于动物源性食品中恩诺沙星残留的检测。
[0012] 本发明的有益效果：本发明检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场 操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批 量样品的检测等优点。
【附图说明】
[0013] 图1是检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸条的结构示意图； 图2是检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的结构示意图； 图3是恩诺沙星药物人工抗原鉴定时所得的SDS-PAGE电泳图； 图4是时间分辨荧光紫外扫描图谱； 图中：1、样品垫，2、金标垫，3、检测线T线，4、质控线C线，5、吸水垫，6、PVC底板，7、NC 膜，8、观察孔，9、点样孔，10、卡套。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图对本发明的技术方案及有益效果作进一步详细的说明。
[0015] -种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，它包括以下步 骤： 步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原： 采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将20 mg恩诺沙星（Enro)，10 mg N -羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，以及12. 5 mg碳二亚胺盐酸（EDC)充分溶解于I mL二甲基甲酰胺（DMF)中，于室温 下搅拌24 h，即可得到恩诺沙星（Enro)反应液，称取牛血清白蛋白（BSA) 50 mg，使之充分 溶解在3 mL pH=7. 2的磷酸盐缓冲液（PBS)中，将恩诺沙星（Enro)反应液逐滴缓慢滴加到 该牛血清白蛋白（BSA)溶液中，并于室温下搅拌3 h，然后用pH=7. 2的磷酸盐缓冲液（PBS) 透析3 d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物质。以200000r/min的速度离心30 min，收