/mL、500ng/mL、1000 ng/ mL、1500ng/mL、2000ng/mL并设1个空白阴性对照，分别插入组装好的试纸条，IOmin后根 据试纸条的显色结果进行判断，每个浓度重复5次试验。当检测线T线颜色明显浅于空白 阴性对照时，即是试纸条的检测限。实验结果如表2所示。
[0044] 表 2
由表2观察结果发现，在所肉眼不能识别到检测线，而质控线颜色为红色。当浓度增至 500ng/mL时，检测线无红色条带出现，质控线出现红色条带。重复试验5次，实验结果一致。 由此判断该试纸条的100%抑制浓度为500ng/mL。
[0045] 所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸包括卡套10、试纸条，试纸 条包括依次重叠粘贴在PVC底板6上的吸水垫5、NC膜7、金标垫2、样品垫1，NC膜7上设 有两条包被线，一条线包被着所述步骤二所制备的抗恩诺沙星克隆抗体兔抗鼠 IgG作为质 控线C线4，另一条线包被着所述步骤一制得的恩诺沙星药物人工抗原作为检测线T线3 ; 金标垫2上包被有步骤四所制备的经过超低温冷冻干燥固化后的免疫时间分辨荧光作为 示踪物。
[0046] 卡套10的外壁上设有观察孔8、点样孔9,观察孔8位于所述质控线C线4和检测 线T线3的上方，点样孔9位于样品垫1的上方。
[0047] 用本发明所述方法制备的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的检 测与应用： (1)特异性测试 将试纸条插入各种恩诺沙星结构类似物：恩诺沙星、环丙沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、二 氟沙星、妥舒沙星、吉米沙星、克林沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙 星，以恩诺沙星和空白样品为对照，IOmin后观察结果。各种类似物标准品用甲醇溶解，然 后用PBS稀释使其浓度为500ng/mL。将恩诺沙星类似物试纸条T线的颜色和恩诺沙星空 白样品T线颜色进行比较，根据颜色的深浅来判断其特异性，试验重复5次。采用间接竞争 测定，按照常规方法计算抗体的交叉反应率，以交叉反应率为指标判断抗体特异性。实验结 果如表3所示，抗体除了与环丙沙星、丹诺沙星分别有62%和43%的交叉反应率，与沙拉沙 星、二氟沙星、妥舒沙星、吉米沙星、克林沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛 美沙星均无交叉反应。
[0048] 表 3
(2)准确度与精密度测试 样品为购买自大型超市标有安全检查标签的猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉，经过高效气相色 谱检测，样品中不含有或者含有量低于高效气相色谱的检出限。样品的前处理方法如前所 述。向样品中添加恩诺沙星标准品，使添加水平分别为l〇〇ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。 每个浓度重复5次，重复3天，并计算回收率和变异系数(结果见表4)，结果表明，恩诺沙星 在不同样品中的回收率在78. 2%~102. 6%之间，变异系数均小于15%。
[0049] 表 4
(3)用本发明所述方法制备的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的应用 本试验选择50头15 kg左右的长大二元杂交去势健康仔猪，随机分为2组，即对照组 和试验组。对照组饲喂不含任何兽药的饲料，试验组饲喂含100mg/kg恩诺沙星的饲料。试 验期间，自由采食，自由饮水。连续饲喂7d后，试验组停止饲喂加药饲料。于停药后0 d、4 d、10 d、14 d分别屠宰试验组猪2头，对照组也分别在停药0 d、4 d、10 d、14 d屠宰1头， 采肌肉和肝脏，同时用试剂盒（ELISA)和液相（HPLC)法同步测定。测定结果见表5,试验结 果表明试纸具有更高的灵敏度，可用于定量检测动物源性食品中的恩诺沙星残留。
[0050]表 5
【主权项】
1. 一种检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法，其特征在于：它 包括以下步骤： 步骤一、化学方法制备恩诺沙星药物人工抗原：采用N-羟基琥珀酰亚胺法，将恩诺 沙星、N-羟基琥珀酰亚胺，以及碳二亚胺盐酸充分溶解于二甲基甲酰胺中，于室温下搅拌 20~28h，即可得到恩诺沙星反应液，称取相应分量的牛血清白蛋白，使之充分溶解在pH=7. 2 的磷酸盐缓冲液中，将恩诺沙星反应液逐滴缓慢滴加到该牛血清白蛋白溶液中，并于室温 下搅拌2~4h，然后用磷酸盐缓冲液透析3d，每天换透析液2次，以除去未反应的小分子物 质；将溶液以20000r/min离心30min，收集上清，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色 粉末； 步骤二、抗恩诺沙星克隆抗体的制备：用步骤一所制备的恩诺沙星药物人工抗原偶联 物免疫Balb/c小鼠，每只小鼠免疫三次后，分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀衆制备免疫 脾细胞，再将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株分泌的抗体亚型为IgG ;采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进 行纯化后免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠IgG高免血清，采用饱和硫酸铵沉 淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG ; 步骤三、时间分辨荧光的制备：采用柠檬酸三钠还原法制备出粒直径为16~18nm的时 间分辨焚光Eu3+; 步骤四、免疫时间分辨荧光的制备：用步骤三制备的时间分辨荧光Eu3+作为标记物标 记恩诺沙星单克隆抗体，试验选择出最佳标记的pH值为6. 0,最佳标记量为lmL，时间分辨 荧光Eu3+标记恩诺沙星单克隆抗体为32. 5 y g，制备出经过时间分辨荧光Eu 3+标记后的恩 诺沙星单克隆抗体免疫时间分辨荧光； 步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星人工抗 原包被在检测线T线处，兔抗鼠IgG多克隆抗体包被在质控线C线处，免疫时间分辨荧光包 被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的宽度 为0. 9~1. 1_，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留的时 间分辨焚光免疫分析试纸。2. 根据权利要求1所述的所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制 备方法，其特征在于：所制得的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸100%抑制 浓度为500ng/mL。3. 根据权利要求1或2所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制 备方法，其特征在于：所述检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸包括卡套、试纸 条，试纸条包括依次重叠粘贴在PVC底板上的吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫，NC膜上设有两 条包被线，一条线包被着所述步骤二所制备的抗恩诺沙星克隆抗体兔抗鼠IgG作为质控线 C线，另一条线包被着所述步骤一制得的恩诺沙星药物人工抗原作为检测线T线；金标垫上 包被有步骤四所制备的经过超低温冷冻干燥固化后的免疫时间分辨荧光作为示踪物。4. 根据权利要求3所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方 法，其特征在于：所述卡套的外壁上设有观察孔、点样孔，观察孔位于所述质控线C线和检 测线T线的上方，点样孔位于样品垫的上方。5. 根据权利要求3所述的检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方 法，其特征在于：所述NC膜型号为Millipore 135。
【专利摘要】本发明涉及生物检测技术领域，公开了一种检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法。它包括化学方法合成药物人工抗原：以恩诺沙星为母核，通过化学方法合成人工免疫原；免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗恩诺沙星的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein？G柱进行纯化，获得抗恩诺沙星的单克隆抗体；免疫时间分辨荧光的制备；恩诺沙星残留快速检测试纸条金标垫的制备、NC膜的包被、样品垫的制备及组装；本发明所制备的检测恩诺沙星Enro残留的时间分辨荧光免疫分析试纸灵敏度高、特异性强、稳定性好，具有结构简单、组装容易、耐腐蚀、重量轻、成本低、适用面广等特点，能够起到良好的堵水上色效果。
【IPC分类】G01N33/94, G01N33/558
【公开号】CN105044365
【申请号】CN201510405135
【发明人】王弋博, 牛小东, 谢晓玲, 李三相, 汪之波, 陈利云, 施海燕
【申请人】天水师范学院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月10日