蒸馏水冲洗时锥形瓶四壁应没有水珠，水面应是水平的，没有形成凹面，说明 锥形瓶可以用来制备时间分辨荧光。
[0028] (3)用容量瓶准确量取IOOmL双蒸水倒入锥形瓶中，然后放入磁力搅拌子，调节磁 力搅拌器到合适的转速，打开加热开关加热到溶液沸腾，5min后用移液枪准确吸取ImL 1% HAuC14溶液于锥形瓶中（形成0. 01% HAuC14的溶液）继续加热至沸腾5min。
[0029] (4)用移液枪吸取1%柠檬酸三钠加到溶液中并继续加热，当加入柠檬酸三钠的 量为3 mL时，制备出来的时间分辨荧光呈现出酒红色，等溶液颜色稳定后继续加热搅拌 15min后，关掉加热开关，室温搅拌至冷却，定容到100mL，置4°C冰箱内保存备用。并在25°C 放置10天之后，没有发生聚沉现象，此时制备的时间分辨荧光溶液为最佳质量。
[0030] (5)吸取适量时间分辨荧光溶液用紫外分光光度仪在可见光范围内（400~700nm) 进行扫描，获得时间分辨荧光的可见光吸收光谱。
[0031] 图4为时间分辨荧光紫外扫描图谱，从图4可以看出，制备的时间分辨荧光溶液 最大吸收峰波长为523nm，最大吸收值为0. 96,根据吸收峰波长与颗粒直径的关系公式 Y=O. 398X+516. 17 (其中Y代表吸收峰波长，X代表颗粒直径)，计算出时间分辨荧光颗粒 大小为17. 16 nm。
[0032] 步骤四、免疫时间分辨荧光的制备： (1)时间分辨荧光标记恩诺沙星单克隆抗体最适PH值的测定： 取6个I. 5mL离心管，1个为对照管，其他每个离心管准确吸取1.0 mL时间分辨荧光溶 液，用 〇· I mol/L K2CO3 或0.5 mol/L HCL 调节时间分辨荧光的pH 值为6·0、6·5、7·0、7·5、 8. 0,然后在每种不同pH值的时间分辨荧光中分别加入1.0 mg/mL的恩诺沙星单克隆抗体 20 μ L，混匀后静置45min，然后再每个离心管中加入10% NaCl溶液15 μ L，静置2h，观察时 间分辨荧光颜色的变化。发现在pH值为6. 0的离心管中没有产生时间分辨荧光的沉淀，说 明pH 6. 0的时间分辨焚光pH值为最佳标记pH值。时间分辨焚光最佳标记pH值为6. 0， 此时每ImL时间分辨荧光溶液添加20 μ L K2CO3溶液。
[0033] (2)时间分辨荧光Eu3+标记恩诺沙星单克隆抗体最佳标记量的测定： 取6个I. 5ml离心管，每个离心管中准确量取1.0 ml时间分辨荧光溶液，用0.1 mol/ L K2CO3调节pH值到6.0,然后在每个离心管中加入35yg、25yg、15yg、10yg、5yg、 1 μ g不同浓度的恩诺沙星单克隆抗体100. 〇 μ L，混匀后静置5min，再加入10%NaCl溶液 100 μ L，静置5min，观察现象。发现加入25 μ g恩诺沙星单克隆抗体的离心管保持时间分 辨荧光颜色不变，说明25 μ g抗体量达到或超过了稳定时间分辨荧光的最低蛋白量。因此， 选择25 μ g的抗体用量为最低蛋白量，在此基础上再加入30%即为试剂抗体用量：25 μ g/ mLX (1+30%) =32. 5 μ g/mL。恩诺沙星单克隆抗体最佳标记量为每毫升时间分辨荧光Eu3+ 添加 32. 5 μ g恩诺沙星单克隆抗体。
[0034] (3)时间分辨荧光标记恩诺沙星单克隆抗体 当时间分辨荧光Eu3+标记恩诺沙星单克隆抗体的各个条件确立以后便可用抗体与 时间分辨荧光进行标记。在标记前，先对制备的时间分辨荧光以2000 r/min的速度离心 lOmin，以除去时间分辨荧光在存储过程中形成的聚合物，以减少它们在标记过程中影响恩 诺沙星单克隆抗体对时间分辨荧光颗粒吸附的影响。
[0035] 标记的具体操作步骤为：准确量取20mL的时间分辨荧光溶液于50mL锥形瓶中，加 入0· lmol/L的K2CO3调pH值为6. 0 ;在搅拌状态下缓慢滴加2. 5mL浓度为0· lmg/mL恩诺 沙星单克隆抗体，搅拌30min ;在搅拌状态下缓慢加入5% BSA至时间分辨荧光溶液终浓度 为1%，继续搅拌30 min ;放置于4°C静置2h。将时间分辨荧光溶液倒入离心管中以2000rpm 离心15min，吸出上清，弃沉淀。以8000 r/min的速度离心30 min，弃去上清夜，加入标记 洗涤保存液至原体积；第二次以12000 r/min的速度离心30 min，弃去上清夜，加入标记洗 涤保存液至原体积；第三次以14000 r/min的速度离心30min，弃去上清夜，沉淀用标记洗 涤保存液溶解后，得到2. OmL浓缩物(为总体积的十分之一)，置4°C冰箱备用。
[0036] 步骤五、恩诺沙星残留检测试纸条的制备：以NC膜作为固相载体，将恩诺沙星人 工抗原包被在检测线T线处，兔抗鼠 IgG多克隆抗体包被在质控线C线处，免疫时间分辨荧 光包被在金标垫中，将吸水垫、NC膜、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的 宽度为〇. 9~1. 1_，将组装好的试纸板切割成试纸条后装入卡套中制得检测恩诺沙星残留 的时间分辨荧光免疫分析试纸； (1)金标垫的制备 配制了 5种不同的金标垫封闭液进行试验： 表1
注："1"为对照；"一"表示未添加。
[0037] 将金标垫浸泡在不同配方的封闭液中，待金标垫被完全浸透后，置于37°C恒温烘 箱中烘干后备用；将兔抗鼠 IgG抗体用磷酸盐（PBS)溶液配制成lmg/mL的溶液，用Bio-dot 划膜仪滑膜，将免疫时间分辨荧光分别喷在经过不同处理的金标垫上后，于37°C干燥后，组 装试纸条，根据实验结果观察3封闭液作为金标垫封闭液，试纸条C线的颜色是红色，宽度 中等，条带清晰，因此选择3封闭液作为金标垫封闭液。
[0038] (2)质控线C线包被浓度的选择 质控线C线包被的是兔抗鼠 IgG抗体。将浓度分别为2. 5mg/mL、2mg/mL、1.5mg/mL、 I. 0mg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL的兔抗鼠 IgG抗体包被到经过选择的NC膜上，与所制备的 金标垫一起组装试纸条，依据显色的条带来选取最佳的包被量。观察结果发现在金标垫的 包被量为10 μ L/cm，NC膜为Milliporel35及当质控线C线包被浓度时I. 5mg/mL时，显色 条带颜色为红色，颜色易于区分，边缘清晰。
[0039] (3)检测线T线包被浓度的选择 检测线T线包被的是恩诺沙星人工合成抗原，其原始浓度为4. Omg/mL，T线的包被浓 度分别为4. 0mg/mL、3. 0mg/mL、2. 0mg/mL、l· Omg/mL和0· 5mg/mL的恩诺沙星人工抗原；观察 结果发现当检测线T线包被浓度2. Omg/mL时，显色条带颜色为红色，颜色易于区分，边缘清 晰。
[0040] (4)检测线T线、质控线C线最佳包被液的选择 恩诺沙星单克隆抗体和恩诺沙星人工抗原在包被之前都要进行稀释，所以选择最佳的 稀释液对其进行稀释，包被到NC膜后，可能会使检测线T线和质控线C线的显色更加清晰 和均一，良好的包被液会使显色条带颜色较深，易于识别，条带的宽度适中。用几种不同的 包被液将恩诺沙星抗原和兔抗鼠 IgG抗体稀释到试验中选择浓度后，用Bio-dot包被在NC 膜上，根据显色条带来判断最合适的包被液。观察结果发现0.0 lM pH 7.2 PBS+1% BSA+1% Sucrose为最佳包被液。
[0041] 样品垫封闭液的选择 样品垫在试验的过程中不能吸附样品中的待测成分，要使试验结果真实可靠，样品垫 在使用前要经过封闭，封闭液中的成分会防止待测成分被吸附而造成结果的不准确。观察 结果发现〇· OlM pH7. 2 PBS+2% BSA+0. 1% TrionX-IOO+ 0.5% Sucrose为最合适的封闭液。
[0042] (6)试纸条的组装 按照图1所示，将NC膜、吸水垫、金标垫、样品垫依次重叠粘贴于PVC底板上，重叠处的 宽度大约为1_。将组装好的试纸板经过切条机切成3_宽度的试纸条后，将试纸条装入塑 料卡套中即可。
[0043] 恩诺沙星检测限确定 将恩诺沙星标准品配制成10mg/mL，然后用磷酸盐溶液（PBS)稀释，使配制的恩诺沙星 溶液使其质量浓度为 0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng