集上清液，真空冷冻干燥即得偶合物Enro-BSA白色粉末。
[0016] 检测抗原Enro-OVA的制备，同样采用N-羟基琥泊酰亚胺法，以70 mg卵清蛋白 (OVA)按照上述步骤代替牛血清白蛋白（BSA)，制备所得偶合物为检测抗原Enro-OVA。
[0017] 将免疫抗原Enro-BSA与检测抗原Enro-OVA进行紫外扫描光谱鉴定，在200~ 400 nm紫外光区对2种偶合物进行扫描，以磷酸盐缓冲液（PBS)为空白对照，对牛血清 蛋白（BSA)、过程BSA、Enro-BSA、恩诺沙星（Enro)与牛血清蛋白（BSA)在磷酸盐缓冲液 (PBS)中的混合物、恩诺沙星（Enro)的磷酸盐缓冲液（PBS)进行紫外扫描，扫描波长范围 为200~350 nm。同样的方法，将卵清蛋白（0VA)、Enr〇-0VA、恩诺沙星（Enro)与卵清蛋白 (OVA)在磷酸盐缓冲液（PBS)中的混合物、恩诺沙星（Enro)的磷酸盐溶液（PBS)进行紫外 扫描，扫描的波长范围为230~400 nm。紫外扫描光谱结果显示复合物与其前体物有不同 的紫外吸收特征，表明与恩诺沙星（Enro)与牛血清蛋白（BSA)成功的实现偶联。
[0018] 采用SDS-PAGE电泳进行人工抗原的鉴定：用浓缩胶5%，分离胶10%，向每个样品孔 分别加入变性处理后的Enro-BSA偶合物和牛血清白蛋白（BSA)溶液IOul，样品在浓缩胶中 恒流（I=15mA )浓缩20min，然后在分离胶中分离2. 5h，得到图3所示的SDS-PAGE电泳图。
[0019] 由图3可以看出，Enro-BSA的条带与牛血清白蛋白（BSA)蛋白条带比较，有明显的 托尾现象，这是由于合成产物为混合物，其含有小分子半抗原与B SA的偶联合成物以及未 反应的BSA。
[0020] 步骤二、抗恩诺沙星克隆抗体的制备： (1)动物免疫：用步骤一所制备的恩诺沙星药物人工抗原偶联物免疫原分别免疫6周 龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100 Pg/O. 2 mL。首次免疫，用无菌0.01 mol/L pH值为7. 4的磷酸盐溶液（PBS)溶解免疫原，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，在小 鼠的颈背部皮下分2~3点注射；加强免疫，用0. 01 mol/L pH为7. 4磷酸盐溶液（PBS)溶解 免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，在小鼠腹腔注射；每次间隔14~21d，第3次 免疫后7~10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免 疫后间隔4周以上，在细胞融合前3~4d，在小鼠的腹腔注射恩诺沙星-BSA抗原100 Pg/O. 2 mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。
[0021] (2)抗诺沙星单克隆抗体的制备：分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免 疫睥细胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠 用75%酒精中浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮 肤，剪开一小口，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，在腹膜上用剪刀(操作时要换一套镊子和剪 刀）剪一小口（在腹部中央)，剪开腹膜(换1套镊子和剪刀)，露出脾脏，用镊子夹住脾脏(再 换1套器械)，用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基 (RPMI-1640)于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒，再补加适量基础 培养基（RPMI-1640)，静置2 min，将上层细胞悬液吸取后，放入腹腔巨噬细胞离心管中，重 复上述操作1次。以1200 r/min的速度离心10 min，除去上清，取得小鼠免疫脾细胞。将 IO8个免疫脾细胞与1~2X 10 7个SP2/0骨髓瘤细胞按照1: 10或1: 5的比例加入50 mL 离心管中，进行混匀，然后于1500 r/min的速度水平离心10 min，弃去上清。将离心管倒 扣在灭菌的吸水纸上，把管中液体吸干。用手指轻轻敲击管底，让沉淀的细胞松动，再把离 心管置于37°C水浴锅中。在I min内缓慢将质量浓度为50%的聚乙二醇溶液（PEG)O. 8 mL 滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞。再继续搅拌30 sec后，静置I min，然 后慢慢加入40 mL RPMI-1640基础培养基（事先进行37°C预温）。加基础培养基方法为： 第I min内逐滴滴入I mL，第2 min内加2 mL，第3 min内加3 mL，第4 min内加其余的4 mL，在每次加培养基时需缓慢加入，并轻轻地搅拌培养基，最后将剩余的RPMI-1640培养基 慢慢加入离心管中；以1000 r/min的速度离心5 min，除去上清。然后用HAT培养基悬浮 混合的细胞，再加入饲养脾细胞。根据需要补加适量的HAT培养基，混合均匀，再将含有饲 养细胞的细胞融合液滴加到96孔细胞培养板上，滴加量约为150 μ L/孔。将培养板置于 37°C、体积浓度为5%的CO2饱和湿度培养箱中，进行培养。用建立的间接ELISA筛选阳性细 胞克隆，选择强阳性集落生长的孔，用有限稀释法进行克隆，并对其他阳性孔，进行24孔扩 大培养，用间接ELISA和间接竞争ELISA对扩大培养孔的上清液进行检测，对间接ELISA和 间接竞争ELISA均为阳性孔的细胞进行液氮冷冻保存。通过融合检测，并进行3次亚克隆 后获得杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株经过多次传代、冻存、复苏，杂交瘤细胞分泌抗体稳定。
[0022] 进行杂交瘤细胞染色体的计数，将每株杂交瘤细胞随机选择20个细胞，进行细胞 染色体条数的计数，再计算细胞染色体条数的平均值。小鼠脾细胞染色体数为40条，SP2/0 细胞的染色体数目平均数为62~68条，而本试验获得的20株杂交瘤细胞染色体数目都在 92~103条之间，平均为97. 8条。本杂交瘤细胞染色体数目高于两亲本细胞的染色体数目， 说明是两种细胞的杂交产物。
[0023] 取所制备的杂交瘤细胞株细胞分泌物培养上清液，进行1:10稀释后，用夹心 ELISA方法测定抗体亚型，该细胞株分泌的抗体亚型为IgGl。采用辛酸一硫酸铵法对小鼠 腹水进行纯化。
[0024] (3)抗恩诺沙星单克隆抗体的纯化 采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化：取小鼠腹水10. 〇 mL，加入等体积的巴比 妥缓冲液，适量的二氧化硅混合，室温振荡30min。室温静置15 min后，取上清于洁净离心 管中，在4°C温度下以1,800 r/min的速度离心20 min;取上清液18. 0 mL，加入36. 0 mL 0. 06mol/L醋酸钠缓冲液，用HCL调节溶液pH值至4. 5,充分搅拌下在30min内缓慢加入辛 酸297μL ;继续搅拌10 min，然后转入4°C冰箱静置2h，4°C，再以15, 000 r/min的速度离心 30 min，上清液经0. 45Mm滤膜过滤后体积为50mL ;加入5. OmL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液， 用NaOH溶液调pH值至7. 6,搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0. 277 g/mL ;4°C冰箱静置 211后，在4°〇温度下以12,00〇1'/111；[11离心30111；[11，弃上清；沉淀用5.01]11^0.11]1〇1凡的磷 酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5, 000 mL 0.01 mol/L pH值为7. 2的磷酸盐缓冲液（PBS)充 分透析后，再用2,000 mL蒸馏水透析，最后用3,000 mL三蒸去离子水透析；然后在温度为 4°C下以12, 000 r/min的速度离心30 min，弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。
[0025] (4)用Balb/C小鼠 IgG免疫健康新西兰大白兔，制备高效价的兔抗鼠 IgG高免血 清，采用饱和硫酸铵沉淀法对血清进行粗提，经葡聚糖凝胶G-200过柱后得到高纯度的兔 抗鼠 IgG。
[0026] 步骤三、时间分辨荧光的制备： 采用柠檬酸三钠（Na3C6H507 · 2H20)还原法来制备时间分辨荧光，具体操作步骤为： (1)从酸缸中取出浸泡24h以上的500mL锥形瓶和磁力搅拌子各一个，先用自来水冲洗 10次，然后用双蒸水冲洗8次左右。
[0027] (2)取以前制备的时间分辨荧光溶液20mL左右，倒入锥形瓶，用保鲜膜封住瓶口， 缓慢晃动锥形瓶，使时间分辨荧光溶液充分的接触锥形瓶的内壁，IOmin后弃去，用双蒸水 冲洗三次。用