一种利用hplc-elsd同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质 体中各组分含量的方法。
【背景技术】
[0002] 脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内形成的微型泡囊体，常用作抗肿瘤药 物载体，现在已经发展成为一类成熟的新型靶向制剂。复合磷脂脂质体是由两种不同的相 变温度组合成的一种脂质体，前期研究表明，不同磷脂组成脂质体的药剂学性质以及药效 差异明显，与单一磷脂脂质体相比，复合磷脂脂质体具有显著的抗肿瘤活性和细胞摄取性 质（彭佩，林爱华，陈军.磷脂组成对马钱子总生物碱隐形脂质体体外抗肿瘤作用[J].中 成药，2014, 36 (2) :57-61.)。
[0003] 脂质体由于稳定性差使其发展受到限制，主要原因为磷脂在储存的过程中容易发 生氧化分解；而磷脂并非单一的化合物，是基架结构相同但脂肪酸链不同的一类物质的混 合物，由此限制了磷脂材料的检测。在已报道的磷脂HPLC检测方法中多为紫外检测器检 测，其灵敏度低；而同时检测复合磷脂脂质体这一总体物质中的大豆卵磷脂（SPC)、氢化大 豆磷脂（HSPC)和胆固醇的方法还未见报道。
【发明内容】
[0004] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用HPLC-ELSD同时测定复 合磷脂脂质体中各组分含量的方法，该方法具有快速、高效、准确和可靠的优点，可以同时 检测复合磷脂脂质体中大豆卵磷脂（SPC)、氢化大豆磷脂（HSPC)和胆固醇的含量，为复合 磷脂脂质体的质量监控提供可靠有力的依据。
[0005] 实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
[0006] -种利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法，包括如下步 骤：
[0007] 1)设置检测条件
[0008] HPLC条件：
[0009] 色谱柱：C18色谱柱；
[0010] 流动相：流动相A为2-6mM乙酸铵缓冲溶液，流动相B为2-6mM乙酸铵甲醇溶液；
[0011] 梯度洗脱：
[0012] 第一阶段：采用流动相A和流动相B的混合流动相洗脱10-15分钟，其中流动相A 的体积百分含量为10-15 %，流动相B的体积百分含量为85-90% ;
[0013] 第二阶段：采用流动相B洗脱35-40分钟；
[0014] 第三阶段：采用流动相A和流动相B的混合流动相洗脱5-15分钟，其中流动相A 的体积百分含量为10-15 %，流动相B的体积百分含量为85-90% ;
[0015] 流速：0? 8-1. 2mL?minS
[0016] ELSD条件：
[0017] 漂移管温度：40-50°C;氮气流速：1. 7-2.ImL?minS增益：4 ;采用分流模式；
[0018] 2)绘制标准曲线
[0019] ①绘制大豆卵磷脂的标准曲线
[0020] I、称取五组大豆卵磷脂标准品，用甲醇分别定容稀释于容量瓶中，分别配制成五 组大豆卵磷脂含量不同的大豆卵磷脂甲醇溶液，将五组大豆卵磷脂甲醇溶液用步骤1)的 检测条件进行检测，得到五组大豆卵磷脂的峰面积；
[0021] II、以大豆卵磷脂的峰面积的对数为纵坐标，以大豆卵磷脂含量的对数为横坐标， 根据各组检测的数据进行绘图，拟合后得到大豆卵磷脂的标准曲线，根据标准曲线得到标 准曲线的函数关系式y=Ic1X+!^;
[0022] ②绘制氢化大豆卵磷脂的标准曲线
[0023] I、称取五组氢化大豆卵磷脂标准品，用甲醇分别定容稀释于容量瓶中，分别配制 成五组氢化大豆卵磷脂含量不同的氢化大豆卵磷脂甲醇溶液，将五组氢化大豆卵磷脂甲醇 溶液用步骤1)的检测条件进行检测，得到五组氢化大豆卵磷脂的峰面积；
[0024] II、以氢化大豆卵磷脂的峰面积的对数为纵坐标，以氢化大豆卵磷脂含量的对数 为横坐标，根据各组检测的数据进行绘图，拟合后得到氢化大豆卵磷脂的标准曲线，根据标 准曲线得到标准曲线的函数关系式y=k2x+b2;
[0025] ③绘制胆固醇的标准曲线
[0026] I、称取五组胆固醇标准品，用甲醇分别定容稀释于容量瓶中，分别配制成五组胆 固醇含量不同的胆固醇甲醇溶液，将五组胆固醇甲醇溶液用步骤1)的检测条件进行检测， 得到五组胆固醇的峰面积；
[0027] II、以胆固醇的峰面积的对数为纵坐标，以胆固醇含量的对数为横坐标，根据各组 检测的数据进行绘图，拟合后得到胆固醇的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数 关系式y=k3x+b3;
[0028] 3)实际复合磷脂脂质体样品的测定
[0029] 称取复合磷脂脂质体样品，用甲醇分别定容于容量瓶中，得到复合磷脂脂质体的 甲醇溶液，将复合磷脂脂质体的甲醇溶液用步骤1)的检测条件进行检测，分别得到大豆卵 磷脂、氢化大豆卵磷脂和胆固醇的峰面积，将大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、胆固醇的峰面 积分别代入大豆卵磷脂标准曲线、氢化大豆卵磷脂标准曲线、胆固醇标准曲线中，分别得到 大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、胆固醇的含量。
[0030] 本发明与现有技术相比，其有益效果和优点在于：
[0031] 1)该检测方法能同时定性、定量分析复合磷脂脂质体中的组分HSPC、SPC合胆固 醇，从色谱图上可知（图4)，各组分间实现基线分离，相互不干扰，误差比较小，十分可靠。
[0032] 2)该检测方法对HSPC、SPC、胆固醇三种组分的精密度及回收率高，符合样品检测 要求，同时三种组分在1~50yg范围内线性关系良好。
[0033] 3)复合磷脂脂质体对磷脂的比例含量测定做出了一定的要求，只有控制复合磷脂 脂质体中磷脂各组分的含量和比例，才能得到稳定、质量均一的脂复合磷脂脂质体。而该 方法可以同时检测复合磷脂脂质体中SPC、HSPC和胆固醇的含量，用此检测方法可验证复 合磷脂脂质体在制备过程中各组分的比例是否稳定，同时也可考察外界条件如储检温度或 储藏条件下对复合磷脂脂质体中各组分比例的影响，为复合磷脂脂质体的质量控制提供依 据。
【附图说明】
[0034] 图1为试验一中大豆卵磷脂（SPC)标准品的HPLC-ELSD色谱图。
[0035] 图2为试验一中氢化大豆磷脂（HSPC)标准品的HPLC-ELSD色谱图。
[0036] 图3为试验一中胆固醇标准品的HPLC-ELSD色谱图。
[0037] 图4为试验一中复合磷脂脂质体的HPLC-ELSD色谱图。
[0038] 图5为试验一中卵磷脂（PC)的HPLC-ELSD色谱图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0040] 实施例1
[0041] 1)设置检测条件
[0042]HPLC条件：
[0043] 色谱仪：Ultimate3000高效液相色谱仪（Thermo公司）
[0044] 流动相：流动相A为4mM乙酸铵缓冲溶液，流动相B为4mM乙酸铵甲醇溶液；
[0045] 梯度洗脱：
[0046] 第一阶段：采用流动相A和流动相B的混合流动相洗脱10分钟，其中流动相A的 体积百分含量为10 %，流动相B的体积百分含量为90%;
[0047] 第二阶段：采用流动相B洗脱40分钟；
[0048] 第三阶段：采用流动相A和流动相B的混合流动相洗脱5分钟，其中流动相A的体 积百分含量为10 %，流动相B的体积百分含量为90%;
[0049]流速：1.OmL?min1
[0050]ELSD 条件：
[0051] 采用 2OOOESELSD检测器（Aeltech 公司）
[0052] 漂移管温度：45°C;氮气流速：1. 9mL ? minS增益：4;采用分流模式。
[0053]2)绘制标准曲线
[0054] ①绘制大豆卵磷脂的标准曲线
[0055] I、称取五组大豆卵磷脂标准品（lipoid公司，纯度>99%)，用甲醇分别定容稀释 于容量瓶中，分别配制成大豆卵磷脂含量为l、2、5、10、50iig的大豆卵磷脂甲醇溶液，将五 组大豆卵磷脂甲醇溶液用步骤1)的检测条件进行检测，得到五组大豆卵磷脂的峰面积；
[0056]II、以大豆卵磷脂的峰面积的对数为纵坐标，以大豆卵磷脂含量的对数为横坐标， 根据各组检测的数据进行绘图，拟合后得到大豆卵磷脂的标准曲线，根据标准曲线得到标 准曲线的函数关系式y=I. 2187x+0. 8261，R= 0. 9988 ;
[0057] ②绘制氢化大豆卵磷脂的标准曲线
[0058]I、称取五组氢化大豆卵磷脂标准品（lipoid公司，纯度>99%)，用甲醇分别定容 稀释于容量瓶中，分别配制氢化大豆卵磷脂含量为l、2、5、10、50iig的氢化大豆卵磷脂甲 醇溶液，将五组氢化大豆卵磷脂甲醇溶液用步骤1)的检测条件进行检测，得到五组氢化大 豆卵磷脂的峰面积；
[0059]II、以氢化大豆卵磷脂的峰面积的对数为纵坐标，以氢化大豆卵磷脂含量的对数 为横坐标，根据各组检测的数据进行绘图，拟合后得到氢化大豆卵磷脂的标准曲线，根据标 准曲线得到标准曲线的函数关系式y=I. 2714x+0. 3287,R= 0. 9930 ;
[0060] ③绘制胆固醇的标准曲线
[0061] I、称取五组胆固醇标准品（lipoid公司，纯度>99%)，用甲醇分别定容稀释于容 量瓶中，分别配制成胆固醇含量为l、2、5、10、50iig的胆固醇甲醇溶液，将五组胆固醇甲醇 溶液用步骤1)的检测条件进行检测，得到五组胆固醇的峰面积；
[0062] II、以胆固醇的峰面积的对数为纵坐标，以胆固醇含量的对数为横坐标，根据各组 检测的数据进行绘图，拟合后得到胆固醇的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数 关系式y=I. 3467x+0. 9752,R= 0? 9994。
[0063] 由大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和胆固醇的标准曲线可以看出，大豆卵磷脂、氢化 大豆卵磷脂和胆固醇在1~50yg范围内线性关系良好。
[0064] 3)实际复合磷脂脂质体样品的测定
[0065] 称取复合磷脂脂质体样品，用甲醇分别定容于容量瓶中，得到复合磷脂脂质体的 甲醇溶液，将复合磷脂脂质体的甲醇溶液用步骤1)的检测条件进行检测，分别得到大豆卵 磷脂、氢化大豆卵磷脂和胆固醇的峰面积，将大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、胆固醇的峰面 积分别代入大豆卵磷脂标准曲线、氢化大豆卵磷脂标准曲线、胆固醇标准曲线中，得到大豆 卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、胆固醇的含量。
[0066] 试验一、本发明的利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法 学验证试验
[0067] 1、仪器与试剂
[0068] 仪器：Ultimate3000高效液相色谱仪（Thermo公司）；2000ESELSD检测器 (Aeltech公司）；RE-201D旋转蒸发仪（巩仪予华仪器有限公司）；DKB-5015恒温水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司）。
[0069] 试剂：HSPC、SPC、胆固醇（lipoid公司，纯度>99% ) ;PC(中国药品生物制品检定 所）；甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯。
[0070] 2、复合磷脂脂质体的制备
[0071] 先取大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和胆固醇，其中大豆卵磷脂和氢