化大豆卵磷脂 的摩尔比为3:1，胆固醇的量为占大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和胆固醇三者总摩尔数的 5%，然后将大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂和胆固醇用乙醇溶解，在60°C恒温水浴下用旋转 蒸发仪旋转蒸发成膜，除去乙醇，然后真空干燥过夜，再用PH为7. 4的磷酸盐缓冲液水合1 小时，得到空白的复合磷脂脂质体。
[0072] 3、溶液配制
[0073]I、HSPC、SPC、胆固醇、PC标准品溶液的配制
[0074] 精密称取HSPC、SPC、胆固醇、PC标准品各20mg，分别加入IOmL容量瓶中，用甲醇 稀释定容，作为对照溶液。
[0075] II、复合磷脂脂质体溶液的配制
[0076] 称取步骤2制备的复合磷脂脂质体适量，用10倍量的甲醇溶解，作为实验溶液。
[0077] 4、检测
[0078] 将含HSPC、SPC、胆固醇、PC标准品的对照溶液和含复合磷脂脂质体的实验溶液用 实施例1的检测进行检测。
[0079] 5、试验结果
[0080]SPC、HSPC、胆固醇标准品的HPLC-ELSD色谱图如图1、图2和图3所示，复合磷 脂脂质体的HPLC-ELSD色谱图如图4所示。从图1中可以看出，SPC标准品的出峰时间 为20. 4min，22. 5min，24. 3min;从图2中可以看出，HSPC标准品的出峰时间为32. 8min， 40. 5min;从图3可以看出，胆固醇标准品的出峰时间为27.Omin;从图4可以看出，HSPC在 32. 8min、40. 6min出峰，SPC在 20. 4min，22. 5min，24. 4min出峰，胆固醇在 27.Omin出峰。 由此可见，复合磷脂脂质体中各组分SPC、HSPC、胆固醇分别与SPC标准品、HSPC标准品、胆 固醇标准品的出峰时间一致，同时复合磷脂脂质体中各组分HSPC，SPC和胆固醇能同时被 检测到，且实现基线分离。
[0081] 从图2和图4可以看出，HSPC有两个出峰，因为HSPC有两种不同脂肪酸结构，分 别是十六烷酸（棕榈酸）和十八烷酸（硬脂酸），所以色谱行为表现为2个出峰。
[0082] 从图1和图4可以看出，SPC有三个出峰，因为SPC并非单一的化合物，而是基架 结构相同但脂肪酸链不同的一类物质的混合物，而蒸发光散射检测器，其特点之一就是进 入散射池中的所有物质都可被检测。
[0083]在比较卵磷脂标准品（PC)在同色谱条件下的色谱行为发现（见图5)，SPC标准 品的出峰时间为20. 479min，22. 263min，24. 410min，PC标准品的出峰时间为20. 486min， 22. 727min，24. 435min，其出峰时间几乎一致；也就是说，PC、SPC作为分子结构与分子量均 非常接近的卵磷脂，其色谱行为表现出高度相似性；基于此，认为SPC标准品中含有保留时 间接近的一系列混合物，故本发明利用SPC、HSPC所有峰面积之总和来计算SPC、HSPC的总 含量。
[0084] 试验二、本发明的利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法 的精密度测定试验
[0085] 1、试验方法
[0086] 称取6组复合磷脂脂质体样品，将6组复合磷脂脂质体样品用甲醇分别定容于容 量瓶中，分别配制成6组复合磷脂脂质体甲醇溶液，即为6组试验溶液，各组试验溶液中 HSPC、SPC、胆固醇含量分别为200、100、100yg?mL\ 6组试验溶液在同样的条件下分别连 续用实施例1的检测方法检测，分别得到6组HSPC、SPC、胆固醇的峰面积。
[0087] 2、试验结果
[0088] 计算HSPC、SPC、胆固醇峰面积的RSD值，分别为I. 9%，2. 0%，I. 5%(n= 3)。由 此可见，本发明的检测方法的精密度很高。
[0089] 试验三、本发明的利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法 的回收率测定试验
[0090] 1、试验方法
[0091] 精密称取HSPC、SPC、胆固醇标准品各9份，将9份HSPC、SPC、胆固醇标准品分别加 甲醇稀释定容，分别配制成9组HSPC甲醇溶液、SPC甲醇溶液、胆固醇甲醇溶液。9组HSPC 甲醇溶液、SPC甲醇溶液、胆固醇甲醇溶液均分为高、中、低3个浓度组。每个浓度组均含有 三组溶液，高浓度：HSPC、SPC、胆固醇的浓度分别200、100、100yg.mL\中浓度：HSPC、SPC、 胆固醇的浓度分别为100、50、50yg?mL\低浓度：HSPC、SPC、胆固醇的浓度分别为20、10、 10yg?mLi。将9组HSPC甲醇溶液、SPC甲醇溶液、胆固醇甲醇溶液在同样条件下用实施 例1的检测方法检测，分别得到9组HSPC标准品、SPC标准品、胆固醇标准品的峰面积。根 据9组HSPC标准品、SPC标准品、胆固醇标准品的峰面积得到9组HSPC、SPC、胆固醇的含 量，从而计算回收率。
[0092] 2、试验结果
[0093] HSPC、SPC、胆固醇标准品的回收率分别为98. 6%，99. 3%，98. 5%。由此可见，本 发明的检测方法回收率很高。
[0094] 试验四、本发明的利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法 在监测不同复合磷脂脂质体制备工艺中的应用
[0095] 1、试验方法
[0096] 采用成膜法、超声法和及挤出法三种工艺方法制备复合磷脂脂质体，每种工艺设 置三个实验组，每种工艺的三个实验组除了HSPC、SPC和胆固醇的投料比不同之外，其他工 艺条件均相同。每种工艺的三个实验组中制备好的复合磷脂脂质体采用实施例1的方法进 行检测。
[0097] 2、试验结果
[0098] 采用成膜法的三个实验组在成膜前后、采用超声法的三个实验组在超声前后、采 用挤出法的三个实验组在挤出前后各组分的变化如表1所示：
[0099] 表1不同工艺条件下复合磷脂脂质体中各组分的比例
[0100]
[0101] 由表1可以看出，采用成膜法、超声法和及挤出法制备复合磷脂脂质体，成膜前 后、超声前后、挤出前后，HSPC、SPC和胆固醇的比例变化不大，由此说明复合磷脂脂质体在 蒸发成膜、探头超声、高压均质挤出等工艺条件下趋于稳定，可用于指导进一步的实验研 究。
[0102] 试验五、本发明的利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法 在不同储藏条件监测复合磷脂脂质体中的应用
[0103] 试验方法：
[0104] 设置三个试验组，三个实验组的复合磷脂脂质体质量相等，且均取自试验一制备 的复合磷脂脂质体，将三个试验组的复合磷脂脂质体分别在4°C、25°C、60°C条件下储藏，在 储藏过程中，各实验组分别取储藏2、4、8、24小时的复合磷脂脂质体用实施例1的方法进行 检测。
[0105] 试验结果：
[0106] 检测的结果见表2:
[0107] 表2不同储存温度条件下复合磷脂脂质体中各组分的比例
[0108]
[0109] 从表2可以看出，随着储藏温度的升高，SPC的含量明显减少，所占的百分比逐渐 减少，胆固醇和HSPC的比例变化不明显，而4°C的条件下各组分的比例变化不明显。随着储 藏温度的升高，复合磷脂脂质体中SPC的含量变化明显，这可能与SPC为天然植物不饱和磷 月旨，其容易氧化有关。
[0110] 实验四和实验五表明，本发明的检测方法可用于监测复合磷脂脂质体在制备、储 藏等过程中各组分的含量变化，为复合磷脂脂质体的质量控制提供可行性方案。
【主权项】
1. 一种利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法，其特征在于包 括如下步骤： 1) 设置检测条件 HPLC条件： 色谱柱：C18色谱柱； 流动相：流动相A为2-6mM乙酸铵缓冲溶液，流动相B为2-6mM乙酸铵甲醇溶液； 梯度洗脱： 第一阶段：采用流动相A和流动相B的混合流动相洗脱10-15分钟，其中流动相A的体 积百分含量为10-15 %，流动相B的体积百分含量为85-90% ; 第二阶段：采用流动相B洗脱35-40分钟； 第三阶段：采用流动相A和流动相B的混合流动相洗脱5-15分钟，其中流动相A的体 积百分含量为10-15 %，流动相B的体积百分含量为85-90% ; 流速：〇? 8-1. 2mL ? min S ELSD条件： 漂移管温度：40-50°C ;氮气流速：1. 7-2. ImL ? min S增益：4 ;采用分流模式； 2) 绘制标准曲线 ① 绘制大豆卵磷脂的标准曲线 I、 称取五组大豆卵磷脂标准品，用甲醇分别定容稀释于容量瓶中，分别配制成五组大 豆卵磷脂含量不同的大豆卵磷脂甲醇溶液，将五组大豆卵磷脂甲醇溶液用步骤1)的检测 条件进行检测，得到五组大豆卵磷脂的峰面积； II、 以大豆卵磷脂的峰面积的对数为纵坐标，以大豆卵磷脂含量的对数为横坐标，根据 各组检测的数据进行绘图，拟合后得到大豆卵磷脂的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲 线的函数关系式y = kiX+bi; ② 绘制氢化大豆卵磷脂的标准曲线 I、 称取五组氢化大豆卵磷脂标准品，用甲醇分别定容稀释于容量瓶中，分别配制成五 组氢化大豆卵磷脂含量不同的氢化大豆卵磷脂甲醇溶液，将五组氢化大豆卵磷脂甲醇溶液 用步骤1)的检测条件进行检测，得到五组氢化大豆卵磷脂的峰面积； II、 以氢化大豆卵磷脂的峰面积的对数为纵坐标，以氢化大豆卵磷脂含量的对数为横 坐标，根据各组检测的数据进行绘图，拟合后得到氢化大豆卵磷脂的标准曲线，根据标准曲 线得到标准曲线的函数关系式y = k2x+b2; ③ 绘制胆固醇的标准曲线 I、 称取五组胆固醇标准品，用甲醇分别定容稀释于容量瓶中，分别配制成五组胆固醇 含量不同的胆固醇甲醇溶液，将五组胆固醇甲醇溶液用步骤1)的检测条件进行检测，得到 五组胆固醇的峰面积； II、 以胆固醇的峰面积的对数为纵坐标，以胆固醇含量的对数为横坐标，根据各组检测 的数据进行绘图，拟合后得到胆固醇的标准曲线，根据标准曲线得到标准曲线的函数关系 式 y = k3x+b3; 3) 实际复合磷脂脂质体样品的测定 称取复合磷脂脂质体样品，用甲醇分别定容于容量瓶中，得到复合磷脂脂质体的甲醇 溶液，将复合磷脂脂质体的甲醇溶液用步骤1)的检测条件进行检测，分别得到大豆卵磷 月旨、氢化大豆卵磷脂和胆固醇的峰面积，将大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、胆固醇的峰面积 分别代入大豆卵磷脂标准曲线、氢化大豆卵磷脂标准曲线、胆固醇标准曲线中，分别得到大 豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、胆固醇的含量。
【专利摘要】本发明公开了一种利用HPLC-ELSD同时测定复合磷脂脂质体中各组分含量的方法，该方法包括如下步骤：1)设置检测条件；2)绘制标准曲线；3)实际复合磷脂脂质体样品的测定。该方法具有快速、高效、准确和可靠的优点，可以同时检测复合磷脂脂质体中大豆卵磷脂(SPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)和胆固醇的含量，用此检测方法可验证复合磷脂脂质体在制备过程中各成分的比例是否稳定，同时也可考察外界条件如储检温度或储藏条件下对复合磷脂脂质体中各组分比例的影响，为复合磷脂脂质体的质量控制提供依据。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105067742
【申请号】CN201510459309
【发明人】彭佩, 陈军, 施红, 杨成雄, 杨洋, 顾薇
【申请人】湖北荆楚理工科技开发有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月29日