一种甜菜碱含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学分析技术领域，尤其是涉及一种甜菜碱含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 甜菜碱（三甲铵基乙酸）为一种氨基酸一一甘氨酸的三甲基衍生物，化学式为 C5H11NO2，甜菜碱分子具有三个有效甲基，呈中性，熔点高达200°C，极易溶于水，易溶于甲 醇。有文献报道，甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶对维生素B12的大量合成具有非常重要的作 用。甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基，分别形成二甲 基甘氨酸和甲硫氨酸，因此甜菜碱在参与维生素B12生物合成过程中的甲基化具有非常重 要的作用。另外，甜菜碱是一种良好的渗透压调节剂，能促进细胞表面对代谢产物的分泌， 从而对细菌产维生素B12具有刺激效果。在保持足够的甲基供应的前提下，较低浓度的甜菜 碱有利于维生素B12的合成。对胞内外产物浓度的比较发现，在产物大量合成期，低浓度甜 菜碱能够明显促进胞外产物的积累。因此，对于维生素B12发酵液中的甜菜碱含量的测定就 显得尤为重要。
[0003] 甜菜碱的结构如下：
[0004]
[0005] 目前甜菜碱的检测方法有酸碱滴定法、比色法、重量法、薄层扫描定量法、凯氏定 氮法、高氯酸非水滴定法、分光光度法、气相色谱法、离子色谱法等，这些方法各具优劣：
[0006] 《中国药典》2005年版收有甜菜碱薄层色谱法含量测定，但该方法干扰因素多，而 且温度和湿度对显色影响较大，重现性差，另有将甜菜碱制成衍生物，再进行高效液相色谱 法进行测定甜菜碱的测定。
[0007] 分光光度法将甜菜碱样品与显色剂发生显色反应而生成有色物质，再使用分光光 度计进行定量测定。样品与冷却的KI混合产生碘化物沉淀，离心后用二氯乙烷溶解沉淀， 在波长为365nm处测定吸光度，通过工作曲线计算出甜菜碱含量，该法干扰因素较多，特别 是在测定低含量样品时误差较大。
[0008] 《兽药质量标准2003》中《盐酸甜菜碱》、NY399-2000、GB/T21515-2008分别是甜 菜碱盐酸盐和甜菜碱产品质量标准，含量检测采用高氯酸非水滴定法。该法是利用甜菜碱 盐酸盐为季胺盐类化合物，用冰醋酸为溶媒，与乙酸汞可形成难电离的氯化汞，并形成季铵 醋酸盐而具有明显的碱性，以结晶紫为指示剂，用高氯酸进行非水滴定。但是该法采用结晶 紫指示剂，终点颜色变化不明显，较难判定终点；采用的高氯酸和冰醋酸有很强的腐蚀性； 高氯酸标准溶液放置过久会变成黄色，对化验室外部环境控制要求较高，受环境温度、湿度 影响较大，要经常配制、标定。利用此法进行检测只要样品中具有碱性基团的化合物如胺 类、氨基酸类、含氮杂环化合物、某些有机碱的盐及弱酸盐、钠离子等，都会影响高氯酸非水 滴定法检测的准确性。
[0009] 以上的各种方法，不仅过程复杂，而且会使用腐蚀性试剂，对于甜菜碱含量的测定 都不是很理想。因此开发一种能够安全、准确测定甜菜碱的含量的方法一直是有待解决的 问题。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种干扰因素少，安全可靠，且 方法简易于操作，结果准确，重复性好的甜菜碱含量的测定方法。
[0011] 为实现上述发明目的所采取的的技术方案为：
[0012] -种甜菜碱含量的测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行检测。
[0013] 所述高效液相色谱法进行检测的具体过程为：采用纯化水为溶剂制备标准品溶液 和供试品溶液，以10-20ul的进样量进样后，按照外标法计算含量；
[0014] 其中高效液相色谱条件为：
[0015] 色谱柱：C18色谱柱，
[0016] 检测器：DAD检测器，
[0017] 流动相：0. 05mol/L己烷磺酸钠溶液：0. 05mol/L磷酸二氢钾溶液= 50. 0-60. 0:40. 0-50. 0，
[0018] 流速：0? 60-1.OOml/min;
[0019] 检测波长：190-196nm。
[0020] 所述标准品溶液和供试品溶液浓度为0?lmg/ml-2.Omg/ml。
[0021] 本发明采用高效液相色谱法进行甜菜碱的含量检测，其方法简单，操作简便，安全 可靠。且通过外标法对样品中甜菜碱含量进行定量，方法准确，简单、重复性好，灵敏度高， 当甜菜碱在〇.lmg/ml-2.Omg/ml之间时，均有较好的线性关系，其线性相关系数为0. 9991。 优于高氯酸滴定法、薄层色谱法和分光度法，为甜菜碱的准确测定提供优良的检测方法。
【附图说明】
[0022] 图1为峰面积和浓度的线性关系图。
【具体实施方式】
[0023] 为了使本领域的技术人员更好的理解发明的技术方案，下面结合具体实施方法对 本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
[0024] 实施例1
[0025] 甜菜碱分析样品的制备：
[0026] 标准品溶液的制备：称取甜菜碱标准品50mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加流 动相溶解并定容至刻度，摇匀。用Iml注射器取溶液经0.45um的有机滤头过滤，得标准品 溶液。
[0027] 供试品溶液的制备：称取甜菜碱样品50mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加流 动相适量，溶解后定容至刻度，摇匀。用Iml注射器取溶液经0.45um的有机滤头过滤，得供 试品溶液。
[0028] 标准品溶液和供试品溶液各制得5份。
[0029] 色谱分析条件：岛津LC-20A液相色谱仪，WatersC18色谱柱（250*4. 6, 5um); 流动相：0? 05mol/L己烷磺酸钠溶液：0? 05mol/L磷酸二氢钾溶液=(50. 0:50. 0);流速： 0.SOml/min;检测波长：192nm;进样量20ul，检测器：紫外检测器；柱温箱30°C。
[0030] 按上述色谱条件，对所有标准品和供试品分别进样，如图1所示，标准品溶液5个 样品分别进样所得峰面积为641612,RSD为0. 15% ;供试品溶液的5个样品所得峰面积平 均值为 358933,RSD为 0. 09%。
[0031] 根据公式：
[0032] 甜菜碱的含量：a=A样M标/A标M样*100%。
[0033] 采用外标法将标准品和供试品平均代入即可得供试品甜菜碱的含量为50. 15%。
[0034] 本发明实施例1所述检测方法的方法学考察：
[0035] 精密度实验
[0036] 称取同一甜菜碱样品，进行6次重复试验，峰面积表1 :
[0037] 表1甜菜碱重复试验的面积
[0038]
[0039] 峰面积RSD为0. 30%，结果表明，本方法检测甜菜碱含量精密度高，重现性好。
[0040] ⑵线性关系考察
[0041] 根据本发明所述方法，用50ml的容量瓶配制浓度为lOmg/ml的储备液，加流动 相分别稀释成 〇?lmg/ml、0. 2mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、I. 5mg/ml、2mg/ml的标准溶液， 按照本方法，对样品浓度⑴和峰面积（Y)进行数据回归分析，线性回归方程为Y= 1.26981X106X-6699.7,R= 0.9993,结果表明甜菜碱在 0?lmg/ml-2.0mg/ml浓度范围内， 峰面积和浓度呈良好的线性关系。
[0042] ⑶加样回收实验
[0043] 准确称取已知含量的甜菜碱适量，再分别精密加入一定量的甜菜碱样品80%， 100%，120%，使供试品溶液中的甜菜碱浓度在甜菜碱标准曲线的高、中、低区域各3份，按 照本发明项下的操作，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为99. 15%，RSD为0. 54%， 表明该方法加样回收率好。
[0044] 综上表明本发明所述含量检测方法稳定性好，精密度高，适合甜菜碱的含量测定。
[0045] 实施例2
[0046] 样品及标准品配制同实施例1。
[0047] 色谱分析条件：岛津LC-20A液相色谱仪，PhenomenexC18色谱柱（250*4. 6, 5um); 流动相：0? 05mol/L己烷磺酸钠溶液：0? 05mol/L磷酸二氢钾溶液=(40. 0:60. 0);流速： 0. 70ml/min;检测波长：190nm;进样量20ul，检测器：紫外检测器；柱温箱30°C。
[0048] 按上述色谱条件，对所有标准品和供试品分别进样，如图1所示，标准品溶液5个 样品分别进样所得峰面积为356794,RSD为0. 33% ;供试品溶液的5个样品所得峰面积平 均值为 375545,RSD为 0? 35%。
[0049] 根据公式：
[0050] 甜菜碱的含量：a=A样M标/A标M样*100%。
[0051] 采用外标法将标准品和供试品平均代入即可得供试品甜菜碱的含量为51. 02%。
[0052] 实施例3
[0053] 样品及标准品配制同实施例1。
[0054] 色谱分析条件：岛津LC-20A液相色谱仪，WatersC18色谱柱（250*4. 6, 5um); 流动相：0? 05mol/L己烷磺酸钠溶液：0? 05mol/L磷酸二氢钾溶液=(60. 0:40. 0);流速： I.OOml/min;检测波长：196nm;进样量20ul，检测器：紫外检测器；柱温箱35°C。
[0055] 按上述色谱条件，对所有标准品和供试品分别进样，如图1所示，标准品溶液5个 样品分别进样所得峰面积为594123,RSD为0. 21 % ;供试品溶液的5个样品所得峰面积平 均值为 325812,RSD为 0? 21 %。
[0056] 根据公式：
[0057] 甜菜碱的含量：a=A样M标/A标M样*100%。
[0058] 采用外标法将标准品和供试品平均代入即可得供试品甜菜碱的含量为51. 55%。
[0059] 实施例4
[0060] 样品及标准品配制同实施例1。
[0061] 色谱分析条件：岛津LC-20A液相色谱仪，PhenomenexC18色谱柱（250*4. 6, 5um); 流动相：0? 05mol/L己烷磺酸钠溶液：0? 05mol/L磷酸二氢钾溶液=(50. 0:50. 0);流速： I.OOml/min;检测波长：196nm;进样量20ul，检测器：紫外检测器；柱温箱30°C。
[0062] 按上述色谱条件，对所有标准品和供试品分别进样，如图1所示，标准品溶液5个 样品分别进样所得峰面积601458为，RSD为0. 25% ;供试品溶液的5个样品所得峰面积平 均值为 384752,RSD为 0? 31 %。
[0063] 根据公式：
[0064] 甜菜碱的含量：a=A样M标/A标M样*100%。
[0065] 采用外标法将标准品和供试品平均代入即可得供试品甜菜碱的含量为51. 25%。
[0066] 上述参照【具体实施方式】对该一种甜菜碱的含量检测方法进行的详细描述，是说明 性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例。因此在不脱离本发明总体 构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种甜菜碱含量的测定方法，其特征在于采用高效液相色谱法进行检测。2. 按照权利要求1所述的甜菜碱含量的测定方法，其特征在于所述高效液相色谱法进 行检测的具体过程为：采用纯化水为溶剂制备标准品溶液和供试品溶液，以10-20ul的进 样量进样后，按照外标法计算含量； 其中高效液相色谱条件为： 色谱柱：C18色谱柱， 检测器：DAD检测器， 流动相：0. 05mol/L己烷磺酸钠溶液：0. 05mol/L磷酸二氢钾溶液= 50. 0-60. 0:40. 0-50. 0， 流速：〇? 60-1. OOml/min ; 检测波长：190-196nm。3. 按照权利要求2所述的甜菜碱含量的测定方法，其特征在于所述标准品溶液和供试 品溶液浓度为0. lmg/ml-2. Omg/ml。
【专利摘要】本发明涉及一种甜菜碱含量的测定方法,该方法是采用高效液相色谱法进行检测。本发明采用高效液相色谱法进行甜菜碱的含量检测，简单方便，准确性高，安全可靠。且通过外标法对样品中甜菜碱含量进行定量，方法准确，简单、重复性好，灵敏度高，当甜菜碱在0.1mg/ml-2.0mg/ml之间时，均有较好的线性关系，其线性相关系数为0.9993。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105067741
【申请号】CN201510457983
【发明人】陈红丽
【申请人】宁夏泰瑞制药股份有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月30日