用于确定介质中的荧光物质浓度的方法和设备的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于确定介质中的荧光物质的浓度的方法，其中，将具有激发波长的激发辐射辐射通过具有荧光物质的介质，从而使荧光物质以这样的方式被激发，使得荧光物质发射具有荧光波长的荧光辐射，其中对荧光辐射的强度进行测量，而介质中的荧光物质的浓度根据测量的荧光辐射的强度而确定。
[0002]另外，本发明还涉及用于确定介质中的荧光物质的浓度的设备，该设备至少包括:第一辐射源，其用于发射具有激发波长的激发辐射；第一传感器，其用于测量由激发辐射激发并具有荧光波长的荧光辐射的强度；以及计算单元，其用于依据荧光辐射的强度来确定荧光物质的浓度。
【背景技术】
[0003]在现有技术中已知用于确定介质中的焚光物质的存在的方法，其中，对焚光物质进行特定激发，以通过激发辐射来发射荧光辐射。对荧光辐射的强度进行测量，以便依据测量结果来推导出荧光物质的存在。但是，因为仅在很少的情况下才可以由荧光辐射的强度推导出荧光物质的浓度，所以一般不认为这样的荧光测量是可靠的定量测量方法。例如在免疫学中，抗体设置有荧光化学基团，因此可以借助于荧光来识别抗体结合的位点。以这种方式还能够进行对抗原的浓度的部分定量确定。
[0004]无论如何，实践观察显示，通常无法在通过对荧光进行测量而进行浓度的确定中获得所需的精度。例如，已经观察到，测量室的几何形状对测量精度有影响。在变化的时间条件下，也无法通过已知方法获得令人满意的结果。目前，该问题尚未得到解决。
【发明内容】
[0005]因此，本发明的目标为，创建之前所提及类型的能够对荧光物质的浓度进行高度精确确定的方法和设备。具体而言，需要降低和/或消除测量室的几何形状对于测量精度的影响。另外，即使在变化的时间条件下，也应当能够精确地进行浓度的确定。
[0006]为实现根据本发明的目标，对激发辐射的透射部分的强度也进行测量，而荧光物质的浓度根据激发辐射的透射部分的强度以及荧光辐射的强度来确定。
[0007]有益地，不仅如同之前的情况测量荧光，而且还考虑到，在具有荧光物质的样本中的激发光的吸收也对测量到的荧光辐射的强度有影响。吸收对于浓度的确定的影响力度会特别地取决于光在样本中传播的距离。因此，吸收的影响主要取决于测量室的几何形状。因为在之前所使用的测量荧光的方法中并没有考虑到这些影响，所以这样不能根据测量到的荧光强度来推导样本中荧光物质的浓度。相反，根据本发明的方法可以用作确定荧光物质的浓度的高度精确的定量方法。已经观察到，在用于确定荧光物质的浓度的方法中，吸收与荧光成比例地增加。这意味着，对荧光进行测量所需的激发光越多地穿透样本介质，其减弱越大，因此得到的荧光信号衰减。另外，在未知样本中事实上经常出现与荧光或引起荧光的物质的浓度没有因果联系的在样本中激发光的吸收。结果，单独对荧光进行测量包含了系统中固有的误差，而该误差不能通过来自荧光的测量的信息而校正。根据本发明，该误差通过对激发辐射的透射部分进行测量而消除，所述激发辐射的透射部分给出了关于激发辐射在穿过测量体积时的吸收的信息。于是，荧光物质的浓度基于荧光以及激发辐射的透射而得到确定。如果样本的浑浊和/或其他原因引起的(例如，添加反应化学成分引起的)激发辐射的吸收增加，导致穿透介质的激发辐射减弱并随后导致荧光信号衰减，则该方法会尤其有益。当单独测量荧光时，不能从较低的荧光中区分出信号的变化，因此在确定浓度时获得了不精确和/或不正确的结果。与此不同的是，同时对吸收和荧光进行测量的益处在于，激发辐射的透射部分可以用于修正由激发辐射在样本中的吸收引起的非线性和不正确的测量。这在例如需要考虑容纳样本的测量室的不同的几何形状时是有益的。另外，在添加反应化学成分(尤其是基质)之后，可以根据吸收与荧光之间的关系而表明关于所添加的反应化学成分的定性状态。本发明的另一益处在于，在较长的测量过程中，可以高精度地区分浓度的变化和样本的透光率的变化。在此尤其优选的是，在具有荧光物质的介质的相同的体积单元同时对荧光的强度和激发辐射的透射的强度进行测量。如果样本是非均匀的或其状态随时间快速改变，则这会是尤其有益的。然而，对于稳定且均匀的样本(这样的样本同样大量存在)，可以在同一的设备或者在分开的测量设备中(还是在同一时间)中一个接着另一个地对荧光与激发辐射的透射进行交替测量。
[0008]根据特别地优选的实施方案，将具有荧光波长的荧光吸收辐射辐射通过具有荧光物质的介质，对荧光吸收辐射的透射部分的强度进行测量，并根据激发辐射的透射部分的强度、荧光辐射的强度以及荧光吸收辐射的透射部分的强度来确定荧光物质的浓度。在该实施方案中，在荧光波长穿过样本时样本的透射和/或吸收因而用作了用于确定荧光物质的浓度的进一步的输入参数。在此，对荧光吸收辐射的透射部分的测量在激发辐射关闭的情况下进行，所以在荧光波长穿过样本时样本的透射可以根据由激发辐射激发的荧光而独立确定。因此，在该实施方案中，荧光物质的浓度根据由荧光辐射和激发辐射的透射以及荧光吸收辐射构成的三元组的测量值确定。在此，激发辐射和/或荧光吸收辐射穿过具有荧光物质的介质时的透射作为校正值而增加至荧光信号。
[0009]为了获得更精确的测量结果，优选为对具有激发波长的散射光的强度也进行测量，并且焚光物质的浓度根据激发福射的透射部分的强度、焚光福射的强度、散射光的强度，以及(如果可用的话，即如果测量了的话)荧光吸收辐射的透射部分的强度来确定。对散射辐射的测量特别地通过第三辐射传感器进行，第三传感器优选为对激发波长敏感，并且/或在第三传感器的上游设置了具有中心波长λ^的合适的带通滤波器。
[0010]为了浓度的高度精确测量，荧光物质的浓度优选为根据一组特征曲线而确定:该特征曲线的组指示根据激发辐射的透射部分的强度、荧光辐射的强度以及(如果可用的话的，即，如果测量了的话的)荧光吸收辐射的透射部分的强度和/或散射光的强度的荧光物质的浓度。该特征曲线的组可以经验性地获得。或者，可以使用将用于确定荧光物质的浓度的输入参数彼此关联的计算模型。
[0011]另外，对于某些应用场合有利的是，特征曲线的组还指示根据介质的pH和/或温度的荧光物质的浓度，因而获得相应地更高维度的一组特征曲线。
[0012]在此尤其有利的是，特征曲线的组是通过在确定荧光物质的浓度之前进行的测量方法而确定的，在该测量方法中，对于若干给定的荧光物质的校准浓度中的每一个，而对测量荧光辐射的强度、激发辐射的透射部分的强度以及(如果可用的话)荧光吸收辐射的透射部分的强度和/或散射光的强度进行测量。有益地，这能够确定荧光物质的浓度与的输入参数之间的明确的关系，所述关系对于测量设置是特定的，所述测量设置用于确定未知的荧光物质浓度。为提高分辨率，有利的是，以本身已知的方式，通过近似曲线来对特征曲线的组的测量点进行插值。如果考虑到散射光，则对于相同的吸收和变化的散射的进行数次测量流程。作为对这样的测量和/或校准方法的替选，也可以通过数学关系而获得浓度与单个测量参数之间的关系。
[0013]为了提高测量精度，有利的是，在测量激发辐射的透射部分的强度之前，在穿过具有荧光物质的介质之后对激发辐射的透射部分重定向。这样，可以以有益的方式避免当在辐射穿过具有荧光物质的介质的方向上对激发辐射的透射进行测量时可能出现的干扰。
[0014]之前提及类型的设备的特征在于，设置了用于测量激发辐射的透射部分的强度的第二传感器，并且具有设定用于根据激发辐