磷酸 水溶液；检测波长：209nm ;流速：0. 5ml · min S柱温：30°C ;进样量10 μ 1。
[0043] (2)对照品溶液的配制：精密称取枸橼酸对照品17. 2mg，置IOml容量瓶，加蒸馏水 溶解并稀释至刻度，超声并摇匀，滤过，取续虑液，作为母液，备用。
[0044] (3)供试品溶液的制备：取样品粉末（过4号筛）2g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入蒸馏水100ml，称定重量，加热回流提取lh，放冷，再精密称定重量，用水补足减失 重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0045] (4)测定：
[0046] a:绘制标准曲线
[0047] 量取对照品溶液0. 30,0. 50,1. 00, 2. 00,4. OOml，分别置于5ml量瓶中，加蒸 馏水溶解并定容至刻度，滤过，分别得到浓度为〇. 10320、0. 17200、0. 34400、0. 68800、 I. 37600mg · ml 1的对照品溶液，按上述条件测定峰面积，以对照品峰面积值（y)为纵坐 标，柠檬酸浓度（X)为横坐标进行线性回归。结果：柠檬酸的质量浓度范围（mg · ml ^、线 性方程及相关系数（r)分别为：线性范围为0. 10320~I. 72000mg · ml \回归方程为y = 1278680x+1614, r = 0· 9999,见表 1。
[0048] 表1对照品浓度与峰面积的关系（η = 2)
[0049]
[0054] CN 105136939 A 说明书 5/7 页
[0055] 方法学考察
[0056] (1)精密度实验精密量取对照品溶液（浓度为I. 72mg · ml 4 I. 07ml于5ml量瓶 中加蒸馏水定容至刻度，得浓度为〇. 36808mg · ml \按上述色谱条件重复进样6次，测得柠 檬酸峰面积值的RSD为I. 01 %，见表3。结果表明该方法精密度良好。
[0057] 表3精密度试验结果
[0058]
[0059] (2)稳定性实验取精密度试验样品溶液（浓度为0· 36808mg ·πι1 ^，每间隔一定时 间进样一次，测定柠檬酸对照品峰面积的RSD值2. 28%，见表4。结果表明柠檬酸对照品峰 面积值在8h内稳定。
[0060] 表4稳定性试验结果
[0061]
[0063] (3)加样回收实验采用加样回收法，取已测知含量的样品（江苏产，批号 20150428,含量为5. 140% )，精密称取柠檬酸对照品50.0 Omg加入其中。按供试品溶液制 备法操作，并按上述色谱条件进行测定，计算回收率，回收率的计算公式如下所示。
[0064]
[0065] 回收率结果见表5。柠檬酸平均加样回收率为98. 29%，结果表明本方法具有良好 的回收率。
[0066] 表5回收率测定结果
[0067]
[0068] (4)重复性实验精密称取样品（江苏产，批号20150428,含量5. 140% ) 2. OOOOg， 按照供试品溶液制备方法制备6份样品，按上述色谱条件进样测定，结果柠檬酸含量的RSD 值为0.63%，见表6。
[0069] 表6重复性试验结果
[0070] CN 105136939 A ^ 丫/丫贝
[0071] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 制备对照品溶液 称取柠檬酸对照品，加水制成浓度为I. 70-1. 73mg ? ml 1的溶液，即得； (2) 制备供试品溶液 称取桑葚药材样品，配制成浓度为15-25mg ? ml 1的水溶液，即得； (3) 色谱条件 色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为0. 1% -1. 0 %的磷酸水溶液； ⑷测试 所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀释成 浓度范围为0. 1-2. Omg ? mL 1的待测对照品溶液5-7个，按照上述色谱条件，分别测定待测 对照品溶液以及对照品溶液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为横坐 标进行线性回归，得到回归方程； 第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归方 程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件为采用Kromasil C18 (250mmX 4. 6mm，5 ym)色谱柱；流动相为0. 6 %的磷酸水溶液。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件还包括：采用紫外检 测器，检测波长为200-240nm，流速：0? 3-1. 5ml ? min S柱温：25-40°C ;进样量5-20 y 1。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的色谱条件为：色谱柱为 &〇11^8；[1(]18(25〇111111\4.6111111，5 11111);流动相：0.6%的磷酸水溶液，检测器：紫外，检测波 长：209nm，流速：0? 5mL ? min \ 柱温：30°C，进样量 10 y 1。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，称取桑葚药材样品之前， 先将样品粉末过4号筛。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤⑵中，将称量好的桑葚药品加 入蒸馏水中，加热回流提取〇. 5-1. 5h，优选为lh。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，所述的待测对照品溶液 的浓度分别为 〇? l〇320、0. 17200、0. 34400、0. 68800、I. 37600mg ? ml 1O8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述回归方程为y = 1278680x+1614,相 关系数r为0.9999。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 制备对照品溶液 称取柠檬酸对照品，配制成浓度为17. 2000mg ? ml 1的水溶液，超声并摇匀，过滤，取过 滤液，即得对照品溶液； (2) 制备供试品溶液 将桑葚药品粉末过4号筛，配制成浓度为15-25mg ? ml \优选为20-22mg ? ml 1的水溶 液，加热回流提取lh，过滤，取过滤液，即得供试品溶液； (3) 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18(250_X4. 6mm，5 ym);流动相：0. 6%的磷酸水溶液，检测器： 紫外，检测波长：209nm，流速：0. 5mL ? min i，柱温：30°C，进样量10 y 1。 ⑷测试 所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀释成 浓度分别为 〇? l〇320、0. 17200、0. 34400、0. 68800、I. 37600mg .ml 1的 5 个待测对照品溶液， 按照上述色谱条件，分别测定5个待测对照品溶液以及浓度为I. 72000mg 1的对照品溶 液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为横坐标进行线性回归，得到回归 方程 y = 1278680x+1614,相关系数 r 为 0. 9999。 第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归方 程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。
【专利摘要】本发明涉及一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法，桑椹药材采用水作为溶剂加热回流提取，利用HPLC法，采用KromasilC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；使用0.6％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流速为0.5ml·min-1；以209nm为检测波长；柱温为30℃，结果表明柠檬酸对照品在0.10320～1.72000mg·ml-1质量浓度范围内线性关系良好(r＝0.9999)；精密度的RSD值为1.01％(n＝6)；测得平均加样回收率为98.29％，RSD值为0.93％(n＝6)，该方法简便、准确、易行，可用于桑椹药材的质量控制。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105136939
【申请号】CN201510623085
【发明人】王四旺, 肖会敏, 刘洋, 史志辉, 史萌
【申请人】陕西君碧莎制药有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月25日