一种以多拉菌素为内标物使用液质联用仪检测羊肌肉组织中伊维菌素残留量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留检测方法领域，特别是涉及到对羊肌肉组织中残留的伊维菌 素进行检测的方法。
【背景技术】
[0002] 伊维菌素（Ivermectin，简称为IVM)是一种新大环内脂类抗生素，阿维菌素 (Avermectins)的第二代衍生物，它与阿维菌素的驱虫机制相同，都是通过加强r一氨基丁 酸（GABA)的作用来实现，GABA是一种抑制性神经递质，在大脑GABA主抑制突触后神经传 导，GABA的释放量增加，是突触后细胞的正常休止位能提高，神经难以将刺激传递给肌肉， 肌肉不能收缩，寄生虫麻痹而被驱除，是阿维菌素家族中最优秀的驱虫药之一，在畜牧业生 产中得以广泛的应用。伊维菌素在农牧业广泛用作抗寄生虫剂和杀螨剂，该类药物具有神 经和发育毒性，世界卫生组织将其归为高毒化合物。由于脂溶性好、代谢慢，长期大量非合 理使用该类药物，会在动物体内造成高残留，从而对人类健康产生巨大的影响。目前，以羊 肌肉组织内伊维菌素残留的检测方法为研究对象的相关报道相对较少；国内用于伊维菌素 残留检测的方法主要有以高效液相色谱为基础的液相色谱紫外线检测法（HPLC-UV)、液相 色谱荧光检测法（HPLC-FLD)与免疫亲和色谱技术（IAC);酶联免疫（ELISA)等。
[0003] 现有技术当中的液相色谱法：是使用液相色谱仪进行组分分离，以紫外分光光度 计为检测器检测各组分的含量。由于伊维菌素分子结构中具有共辄二烯结构，在245nm波 长处有强的紫外吸收，在此光谱区域存在着脂类、皮质激素、维生素、核酸等众多内源性物 质，紫外检测器的灵敏度太低，易受杂质干扰，所以高效液相色谱紫外线检测法（HPLC-UV) 已无法满足目前农产品中阿维菌素及其有毒代谢物的残留分析要求。
[0004] 现有技术当中的酶联免疫吸附法：利用抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为 基础，依靠比色来确定药物残留情况的检测方法，目前已有部分特异性的酶联免疫试剂盒 投入使用，但是，免疫分析检测具有一定的盲目性，我国市场上酶联免疫法成品试剂盒大多 从国外进口，酶联免疫法的应用范围受到较大的限制。
[0005] 现有技术当中的液相色谱荧光检测法：是利用液相色谱对化合物进行分离， 然后利用化合物的紫外或荧光特性进行定性定量鉴定，特别是液相色谱-荧光检测法 (HPLC-FLD)，具有选择性好、灵敏度高、成本相对较低且易于推广等特点，检出限可达lppb， 但这种检测方法需要进行衍生化，操作复杂，不适合进行大量的实用性检测。
[0006] 现有技术当中的液相色谱质谱检测法，多采用外标法定量。质谱检测器的检测较 灵敏，许多因素会造成检测的不准确性，这些容易引起色谱峰面积不稳定，造成定量不准确 等问题。如GB/T21320-2007等，其批内变异系数< 20%批间变异系数< 30%，变异较大。
[0007] 现伊维菌素残留检测净化技术中，多采用乙腈饱和正己烷的液-液萃取法和C18柱、中性氧化铝柱和碱性氧化铝柱的固相萃取法。乙腈饱和正己烷的液-液萃取法，伊维菌 素微溶于正己烷，在去除杂质的同时也会有一定量伊维菌素的损失。GB/T21320-2007则选 用了（：18和C8固相萃取柱进行双重净化，操作程序复杂繁琐。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术存在的不足，本发明解决的技术问题为：提供一种用于羊肌肉组织 中伊维菌素残留的检测方法，通过对现有前处理技术的优化和细化，获得了良好的富集净 化效果，通过加入多拉菌素内标，进行液相色谱-串联质谱法检测，提高了检测方法灵敏 度、重复性和准确度，适合大批量样品检测。
[0009] 本发明实现上述目的所采用的技术方案如下： 一种以多拉菌素为内标物使用液质联用仪检测羊肌肉组织中伊维菌素残留量的方法， 包括如下步骤： 步骤一、提取 称取剪碎混匀的新鲜羊肌肉组织2. Og至50mL离心管中，加8mL乙腈，高速匀浆lmin， 祸旋振荡2min，超声5min，4000r/min离心10min，取上清液；再用8mL乙腈洗涤勾衆刀头， 洗涤液祸旋振荡2min，超声5min，4000r/min离心10min，取上清液；合并上清液，得到提取 液； 步骤二、固相萃取 向碱性氧化铝固相萃取柱中添加无水硫酸钠 2g，先用IOml乙腈过柱活化，再将步骤一 中的提取液过柱，保持流速在1~I. 5mL/分钟，再用3mL乙腈洗柱，收集全部流出液，氮气 吹干； 步骤三、进样 步骤二吹干得到的残渣用1.0 mL乙腈溶解，再加入50 μ L浓度为Wg/mL的多拉菌素 内标液，涡旋30s，过0. 22 μ m滤膜后，上液质联用仪进行检测； 步骤四、标准曲线的制备 分别准确量取一系列浓度的伊维菌素标准工作溶液，依次加入到空白羊肌肉组织，再 按步骤一至三处理，绘制标准曲线； 采用内标法定量，根据步骤三和步骤四的结果计算羊肌肉组织中伊维菌素的含量。
[0010] 进一步，液相色谱条件为：CS柱；流动相A:乙腈，流动相B :含0. lvt%甲酸的 lOmmol/L乙酸铵水溶液，按VA:VB=90 :10比例混合；流速：0. 2mL/min ;柱温：25°C ;进样 量：5μL。
[0011] 本发明的优点和产生的有益效果是： 本方法采用多拉菌素作为伊维菌素的内标物，消除检测中各种因素的干扰，利于准确 定量。本方法根据伊维菌素的分子结构、物化特性以及碱性氧化铝柱特点，采用杂质吸附模 式（乙腈溶解-乙腈洗脱-收集乙腈流出液和乙腈洗脱液）即收集所有流出液，反相吸附原 理，碱性氧化铝固相萃取柱在无水的弱极性溶剂乙腈中，通过表面铝原子中心与带高负电 荷的杂原子如氧原子形成较强的极性作用力，选择吸附极性较强的脂肪等杂质，收集所有 流出液，从而有效去除杂质干扰，提高羊肌肉组织中残留伊维菌素的富集和净化效率。
[0012] 本发明方法具有检测限低，灵敏度高，变异系数低，测定结果准确可靠的优点，适 合实验室中大批量羊肌肉组织中伊维菌素残留的检测。
【附图说明】
[0013] 图1伊维菌素（a)与多拉菌素（b)的化学结构图。
[0014] 图2是本发明的实施例一中的（羊肌肉组织添加20ng/mL伊维菌素标准溶液样品 与50 μ L多拉菌素内标液（Wg/mL))检测目标物的色谱图。
[0015] 图3是多拉菌素（a)与伊维菌素（b)的质谱图。
[0016] 图4是不同离子源去溶剂气温度对离子加合物形态的影响。
[0017] 图5是伊维菌素的标准曲线。
【具体实施方式】
[0018] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019] 主要材料与试剂： 针筒式微孔滤膜过滤器（〇. 22 μ m，有机系）：天津津腾实验设备有限公司； 乙腈、甲酸和乙酸铵：色谱纯，美国fisher公司； 无水硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司； 屈臣氏纯净水：屈臣氏公司； 固相萃取小柱：碱性氧化铝小柱，美国sepax公司； 伊维菌素标准品：含量99. 5%，中国食品药品检定研究院； 内标物多拉菌素：含量96. 0%，德国DrEhrenstorferGmbH。
[0020] 主要仪器与设备： 安捷伦1200-6410液质联用仪（HPLC-MS/MS):美国Agilent公司； 高速匀浆机：江苏金坛市荣华仪器公司； KL512型氮吹仪：北京康林科技有限责任公司； 湘仪离心机：湘仪公司； 祸旋振荡器：HerosBIO, RS_2shaker ; KQ-600DE型超声清洗仪：昆山超声清洗仪器厂。
[0021] 实施例1不同离子源去溶剂气温度对离子加合物形态的影响 ESI离子源为软电离方式，伊维菌素在ESI离子源内通常与H+，Na+，NH/等结合而形成 准分子离子峰，其中，[M+Na]+离子结构稳定，若对其进行二级质谱裂解，不易得到碎片离 子，且H+，NH4+等可竞相与目标分子结合，从而引起[M+Na] +离子丰度极不稳定，所以质谱检 测时多选用[M+NH4]+为母离子。
[0022] -、液相色谱与质谱条件 1、液相色谱条件 分析柱：安捷伦ZORBAXEclipSePlusCs柱；流动相A:乙腈，流动相B :含0. 1%甲酸(体 积百分数）的IOmmoVL乙酸铵水溶液；流速：0. 2mL/min ;柱温：25°C ;进样量：5μL。
[0023] 2、质谱条件 电喷雾离子源（ESI)，正离子模式，动态多反应监测（DynamicMRM)方式采集，毛细管电 压4kV，碰撞气（N2)流速10L/min，雾化器压力30psi。
[0024] 二、实验步骤 选用不同离子源去溶剂气温度，150 °C、200 °C、250 °C、300 °C和350 °C，使用质谱的全扫 描模式，进样伊维菌素标准溶液，观察不同离子源去溶剂气温度下伊维菌素母离子加合物 形态，伊维菌素的[M+Na]+母离子峰为m/z897. 5, [M+NH4]+母离子峰为m/z892. 5。
[0025] 三、结果 实验结果如图4所示，图4