一种糖化血清蛋白检测试剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种糖化血清蛋白检测试剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖化血清蛋白（Glycosylatedserumprotein，GSP)是血清中各种蛋白质与葡萄 糖发生缓慢的非酶促糖化反应的产物。测定糖化血清蛋白的浓度可以反映人体前2-3周内 的平均血糖水平，而且不受当时血糖浓度的影响，是糖尿病患者血糖监控的良好指标。因 此，糖化血清蛋白的测定在糖尿病的诊断、近期监控和疗效评价方面均具有重要的意义。
[0003] 糖化血清蛋白的检测方法最初是使用放射标记技术、过硫代巴比吐酸法、亲和层 析法等，但是由于以上的检测方法操作繁琐，测定结果准确性低，逐渐被其他检测方法所替 代。随着对糖化血清蛋白检测方法的不断改进，目前，临床上糖化血清蛋白的检测方法主要 为酮胺氧化酶法和硝基四氮唑蓝比色法（NBT)。
[0004] 中国专利申请200710000822.X公开了一种糖化血清蛋白的酶法测定方法及液体 稳定试剂，该酶法测定的原理是通过菠萝蛋白酶消化糖化血清蛋白产生果糖氨基酸，果糖 氨基酸氧化酶作用于果糖氨基酸产生H2O2,H2O2在过氧化物酶的催化下与色原DA-64反应 产生一种绿色的物质，从而达到检测糖化血清蛋白的目的。虽然上述的液体稳定试剂无需 复溶，可以直接使用，而且反应后的产物污染性小。但是，该液体稳定试剂中酶的活性下降 较快，试剂稳定性较差，检测结果容易受外界因素的干扰，导致检测结果重复性低。
[0005] 中国专利CN103197084B公开了一种稳定的糖化血清蛋白检测试剂及应用，该检 测试剂采用双试剂，将NBT储存在试剂Rl的中性pH环境中从而解决了NBT在碱性环境中易 析出，体系浑浊的问题，并且该检测试剂采用了新的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214， 可以显著改善测定性能，保证了试剂检测结果的准确度和稳定性，满足临床的需要。但是， 该糖化血清蛋白检测试剂对pH值、反应时间和反应温度要求较高，线性相对较窄，容易受 到血清中其他物质的干扰，且其反应后的生成物对仪器污染较大，大大的限制了该糖化血 清蛋白检测试剂的应用。
[0006] 鉴于目前糖化血清蛋白检测试剂存在的诸多缺陷，研究和发开出一种稳定性高， 检测结果误差小，检测结果重复性高的糖化血清蛋白检测试剂是目前亟需解决的难题。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术中糖化血清蛋白检测试剂存在检测结果准确性差、重复性低， 抗干扰能力低的缺陷，本发明的目的是提供一种糖化血清蛋白检测试剂及其应用，以解决 上述问题。
[0008] 本发明提供了一种糖化血清蛋白检测试剂，该试剂包括体积比为3:1的试剂Rl和 试剂R2,所述试剂Rl包括以下组分： 磷酸钾缓冲液10-30mmol/L、尿酸酶2-10U/ml、抗坏血酸氧化酶8-20U/ml、烷基醇酰 胺聚氧乙稀醚20_60mmol/L、多元醇5-10mg/ml、氯化I丐25-45ymol/L和防腐剂0? 1-lg/L; 所述试剂R2包括以下组分： 1￡3缓冲液0.1-2臟〇1/1、烷基聚葡萄糖苷30-80臟〇1/1、2-(4-碘苯)-3-(2,4-二硝 基苯 1) -5- (2, 4-二磺基苯I)-2H-四氮唑 0. 1-1. 5mmol/L和防腐剂 0. 1-lg/L。
[0009] 进一步地，所述糖化血清蛋白检测试剂包括体积比为3:1的试剂Rl和试剂R2,所 述试剂Rl包括以下组分： 磷酸钾缓冲液20mmol/L、尿酸酶6U/ml、抗坏血酸氧化酶12U/ml、烷基醇酰胺聚氧乙 稀醚40mmol/L、多元醇6mg/ml、氯化|丐35ymol/L和防腐剂0? 2g/L; 所述试剂R2包括以下组分： 1￡3缓冲液1臟〇1/1、烷基聚葡萄糖苷45臟〇1/1、2-(4-碘苯）-3-(2,4-二硝基苯 1) -5- (2, 4-二磺基苯I) -2H-四氮唑 0? 5mmol/L和防腐剂 0? 2g/L。
[0010] 进一步地，所述磷酸钾缓冲液的pH值为6. 5-7. 5,优选pH值为7. 0。
[0011] 进一步地，所述MES缓冲液的pH值为9. 5-10. 8,优选pH值为10. 5。
[0012] 进一步地，所述防腐剂为对羟基苯甲酸酯。
[0013] 进一步地，所述多元醇为1，2-丙二醇或乙二醇。
[0014] 本发明的MES缓冲液是2-吗啉乙磺酸（MES)缓冲液，2-吗啉乙磺酸的分子式为 C6H13NO4S,CAS号为 4432-31-9。2- (4-碘苯）-3- (2, 4-二硝基苯 1)-5- (2, 4-二磺基苯 I) -2H-四氮唑（WST-3)的分子式为C19H1QIN6Na01QS2,CAS号为 515111-36-1。
[0015] 烷基醇酰胺聚氧乙烯醚是一种非离子表面活性剂，具有生物降解性好、温和、低刺 激、无毒的优点，该烷基醇酰胺聚氧乙烯醚与尿酸酶和抗坏血酸酶混合使用，可以有效的清 除血清中的干扰物质，保证试剂检测结果的准确性。烷基聚葡萄糖苷是一种非离子表面活 性剂，具有杀菌性能强、配伍性好的优点，可以有效的提高试剂的稳定性。WST-3是一类水溶 性极佳的四氮唑盐，并且在分析仪管道上无粘附性，以WST-3作为测定糖化血清蛋白的色 原，可以显著的提高反应体系的水溶性和测定结果的灵敏度和准确度。
[0016] 本发明提供的糖化血清蛋白检测试剂的检测原理:WST_3在碱性环境中可以与糖 化血清蛋白反应形成黄色络合物，通过测定黄色络合物的吸光度值，从而测定出糖化血清 蛋白的浓度。
[0017] 本发明提供的糖化血清蛋白检测试剂是采用两点法终点法检测，该试剂的检测 方法包括以下步骤：采用自动生化分析仪进行检测，其反应温度设置为37°C，主波长设为 405nm，副波长设为546nm，加入样品，将试剂Rl加入样品中反应4-8min，接着加入试剂R2 反应2-4min，开始读取第一点吸光度值，2min后读取第二点吸光度值，与标准比较后定量。
[0018] 另外，本发明还提供了糖化血清蛋白检测试剂在检测糖化血清蛋白中的应用。
[0019] 总之，与现有技术相比，本发明提供的糖化血清蛋白检测试剂具有抗干扰能力强、 测定灵敏度高、检测结果精密度高和重复性好的优点，而且该试剂稳定性高、水溶性好，是 一种理想的糖化血清蛋白检测试剂，有利于该试剂的推广和应用。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例2的检测试剂与美国DiazymeLaboratores酶法测定试剂的线性相 关图。
【具体实施方式】
[0021] 以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发 明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替 换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
[0022] 实施例1、糖化血清蛋白检测试剂 糖化血清蛋白检测试剂包括体积比为3:1的试剂Rl和试剂R2,所述试剂Rl包括以下 组分： pH值为6.5的磷酸钾缓冲液lOmmol/L、尿酸酶2U/ml、抗坏血酸氧化酶8U/ml、烷基 醇酰胺聚氧乙稀醚20mmol/L、l, 2-丙二醇5mg/ml、氯化|丐25 ymol/L和对羟基苯甲酸酯 〇. lg/L； 所述试剂R2包括以下组分： pH值为9. 5的MES缓冲液0.lmmol/L、烷基聚葡萄糖苷30mmol/L、2-