一种检测肉鸡粪便中洛克沙胂及其降解产物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学分析检测领域，具体涉及一种动物排泄物中有机砷的形态分析检 测方法。
【背景技术】
[0002] 洛克沙胂（3-硝基-4-羟基苯砷酸，Roxarsone)是一种有机砷（As)化合物，因其 具有抗菌和促生长效果，可作为添加剂在肉鸡饲料中使用。洛克沙胂在动物体内很少被降 解，多是以原药的形式随粪便排出，进入环境产生严重的局部砷污染。在生态环境日趋恶化 的今天，人们对有机砷制剂在环境中的降解、迀移以及对环境生物造成的影响越来越关注， 洛克沙胂主要通过畜禽粪便进入环境，进入环境后，可能通过生物的或非生物的降解反应 转变为迀移能力更强、毒性更大的含砷化合物，但迄今人们对这一过程还不甚了解。为了研 究洛克沙胂随畜禽粪便排出后的迀移转化规律，评估洛克沙胂在环境中的残留状况与生态 毒理学，急需建立一种快速准确的方法对洛克沙胂及其降解产物予以分析。
[0003] 有机砷及其降解产物均属极性化合物，其在复杂环境样品中的分析方法首选是 高压液相色谱（HPLC)法，将HPLC的分离优势与串联质谱（MS/MS)的鉴别特异性结合，必 能进一步提高检测的准确度与灵敏度。迄今已有部分利用HPLC-MS/MS检测有机砷化物 的文献报道，但研究目标多为检测土壤和食品基质中的有机砷残留及其降解产物，而利用 HPLC-MS/MS检测畜禽排泄物中洛克沙胂转化产物的研究相对较少。因粪便成分复杂，样品 基质极大地影响待测化合物在质谱中的离子化，所以必须对样品进行必要的提取净化前处 理，以减少基质干扰。
[0004] 然而，前人的研究多着眼于总砷含量及无机砷形态的分析，如现有的关于砷测定 的标准包括：土壤总砷测定的行业标准NY/T1121. 11-2006 ;水质砷测定的行业标准SL 327. 1-2005 ;食品添加剂中总砷测定的国家标准GB/T5009. 76-2003 ;稻米中总砷测定的 行业标准NY/T1099-2006 ;饲料中总砷测定的国家标准GB/T13079-2006 ;以及食品中总 砷及无机砷测定的国家标准GB/T5009. 11-2003,此外，与砷测定有关的专利包括：水产品 中无机砷的测定方法（授权公告号：CN101261258B)等，上述方法均不涉及有机砷形态的 分析测定。由于检测方法的不完善，导致洛克沙胂通过粪便进入环境后的降解途径尚不清 楚。因此，寻求一种有效检测牲畜粪便中洛克沙胂及其有机降解产物也是目前研究环境中 有机砷及其降解产物的首要任务。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是针对上述技术缺陷提供一种检测肉鸡粪便中洛克沙胂及其 降解产物的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明首先提供了一种检测肉鸡粪便中洛克沙胂及其降解产物 的方法，包括如下步骤：
[0007] 1)使用甲醇/水作为提取液对粪便样品进行提取；
[0008] 2)采用固相萃取柱进一步浓缩净化样品；
[0009] 3)使用高效液相色谱一离子阱一飞行时间质谱联用仪进行分析。
[0010] 进一步地，上述步骤可优化为：
[0011] 1)将粪便样品进行冷冻干燥，在冷冻干燥的样品中加入体积比为1:9的甲醇/水 溶液进行超声提取，将提取液进行尚心；
[0012] 2)将固相萃取柱进行固定，活化萃取柱，加入步骤1)中获得的上清液，再用淋洗 液进行冲洗小柱，淋洗后再用洗脱液进行洗脱，将洗脱液进行过滤；
[0013] 3)使用高效液相色谱一离子阱一飞行时间质谱联用仪进行分析。
[0014] 本发明的一个优选方面，步骤1)中粪便样品与甲醇/水溶液的质量体积比是 1:20 ~60g/ml;
[0015] 超声提取的条件是：室温下超声提取30~50min;
[0016] 离心的速率是：10000-15000转/分钟。
[0017] 更近一步地，步骤1)可优化为：将粪便样品进行冷冻干燥，按照样品与甲醇/水溶 液的质量体积比1:20~60g/ml在冷冻干燥的样品中加入体积比为1:9的甲醇/水溶液， 在室温下进行超声提取30~50min，提取液以10000-15000转/分钟速率离心。
[0018] 本发明的另一个优选方面，上述步骤2)中用lmL甲醇和lmL超纯水活化萃取柱；
[0019] 加入上清液的量为1ml;
[0020] 冲洗小柱的淋洗液的量为1ml;
[0021] 洗脱小柱的洗脱液的量为1ml;
[0022] 洗脱的速度为1.OmL/min;
[0023] 过滤的条件为：0. 45微米微孔滤膜过滤。
[0024] 其中，上述的淋洗液为体积比为95:5的0· 05mol/L乙酸钠/甲醇，pH为7 ;洗脱液 为体积比为5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/水，pH为2。
[0025] 更近一步地，步骤2)可优化为：将固相萃取小柱固定，用lmL甲醇和lmL超纯水活 化萃取柱，然后加入lmL离心所得的提取上清液，再用lmL体积比为95:5的0. 05mol/L乙 酸钠/甲醇淋洗液冲洗小柱，淋洗后用lmL体积比为5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/ 水洗脱液以1.OmL/min的流速洗脱，洗脱液再经0. 45微米微孔滤膜过滤。
[0026] 本发明的有益效果：本发明首先是根据洛克沙胂的理化性质，选取水相比例较高 的提取液对复杂基质中的微量待测物进行有效提取，并根据其等电点，调节洗脱液的pH值 保证洛克沙胂被充分洗脱，提高回收率。试验结果表明采用体积比为1:9的甲醇/水提取 鸡粪样品中的洛克沙胂残留，可以获得较高的提取率。此外，本发明再采用固相萃取柱进一 步净化样品时，使用的是经多次优化获得的pH为2,体积比为5:65~75:20~30的甲酸 /甲醇/水的洗脱液，该优化的洗脱液既能保证获得理想的回收率，又能去除样品中的一些 极性化合物杂质，以降低质谱检测中的背景干扰。利用高压液相色谱法分析该方法的加标 回收率，结果表明，外标均有较高的回收率，可见本发明提供的分离方法的回收率能满足后 续检测的要求，因而是非常理想的分离肉鸡粪便中洛克沙胂及其降解产物的方法。
[0027] 本发明提供的利用高效液相色谱一离子阱一飞行时间质谱联用仪（LCMS-IT-T0F) 检测肉鸡粪便中的洛克沙胂及其降解产物的方法，经离子阱一飞行时间串联质谱分析后表 明，洛克沙胂（质谱中的相对质荷比为m/z261. 94)在肉鸡粪便中的降解产物有以下三种， 分别为：4-羟基-3-硝基苯基二氧化砷（m/z243. 92) ;4-羟基-3-硝基苯酚（m/z153. 01) 和3,4-二羟基苯酚（m/z122. 91)。可见，利用离子阱一飞行时间多级串联质谱分析洛克沙 胂及其降解产物的方法具有简单易行，高效准确的特点。
【附图说明】
[0028] 图1为实际样品的液相色谱图，其中洗脱时间为7. 2min的特征峰为洛克沙胂；以 及
[0029]图2为洛克沙胂以及三种代谢产物的质谱检测结果，其中（2a)中①为质荷比 为261. 93的洛克沙胂（3-硝基-4-羟基苯砷酸）；（2b)中②为质荷比为243. 92的4-羟 基-3-硝基苯基二氧化砷；（2c)中③为质荷比为153. 01的4-羟基-3-硝基苯酚；（2d)中 ④为质荷比为123. 01的3,4-二羟基苯酚。
【具体实施方式】
[0030] 目前现有的畜禽粪便样品处理方法中，洛克沙胂加标回收率太低，不能满足检测 要求，其原因可能是洛克沙胂与粪便样品中的金属离子等杂质相结合形成难提取物质，本 发明为了克服上述技术缺陷，首先根据洛克沙胂的理化性质，选取水相比例较高的提取液 对复杂基质中的微量待测物进行有效提取，并根据其等电点，调节洗脱液的pH值保证洛克 沙胂被充分洗脱，提高回收率。试验结果表明采用体积比为1:9的甲醇/水溶液提取鸡粪 样品中的洛克沙胂残留，可以获得较高的提取率，而且采用固相萃取柱进一步净化样品时， 优化的pH为2,体积比为5:65~75:20~30的甲酸/甲醇/水的洗脱液既能保证获得理 想的回收率，又能去除样品中的一些极性化合物杂质，以降低质谱检测中的背景干扰，因而 是较为理想的前处理方法。
[0031] 本发明又采用离子阱一飞行时间联用质谱仪对预处理过得样品进行检测，本发明 所用的离子阱一飞行时间联用质谱仪是将高效液相色谱和离子阱质谱仪（IONSTRAP)以及 飞行时间质谱仪（TOFMS)串联起来，其在准确质量数分辨率和灵敏度方面较其它质谱法有 较大提高，能够准确提供分子的质量信息，增加了分子式确定的可信度，是鉴定有机化合物 的有力手段。故本发明利用LCMS-IT-T0F质谱仪鉴定有机化合物分子结构的优势，检测肉 鸡粪便中洛克沙胂及其有机降解产物。
[0032] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明 的范畴：
[0033] 实施例1肉鸡粪样中洛克沙胂回收试验
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