高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及添加剂检测领域，尤其设及甜味剂的检测方法，具体是指一种高效液 相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法。
【背景技术】
[0002] 由于甜味剂有掩盖饲料原料异味和改善饲料适口性的作用，被广泛使用在在饲料 行业中。目前在饲料工业应用的甜味剂已由传统的单一甜味剂(糖精钢)转变为复配型，即 W糖精钢为主，并加增效剂(A-K糖、甜蜜素、阿斯己甜等)和长效甜味剂(新甲基澄皮巧二氨 查耳酬、纽甜等)而组成的复合物。复合甜味剂利用不同甜原料在口腔中的味觉时间差W及 各甜原料之间的协同效应，提高甜味剂的甜度，改善甜味剂的甜感，能够达到更好的诱食效 果。因此，如何有效的监控复合甜味剂的成分和含量，已成为饲料公司、养殖户W及饲料添 加剂公司的关注热点。
[0003] 目前，关于甜味剂的检测方法很多，最常见的有高效液相色谱-紫外检测法、毛细 管气相色谱法、紫外分光光度法等，但运些检测方法大多是针对单一甜味剂或两种甜味剂 进行测定，检测灵敏度也有待提高。因此，当需要检测复合甜味剂中的甜味剂成分时，需要 采用各自的前处理技术和分析方法，检测费时、费力，并且消耗资金大。也有采用超高压液 相色谱-飞行时间质谱仪、超高效液相色谱-Ξ重四级杆串联质谱仪检测多种甜味剂的报 道，但运巧中分析仪器造价高昂，不便于在我国普遍推广。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够实现的高效液相色 谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明的方法具有如下构成：
[0006] 该一种能够实现的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，其 主要特点是，所述的包括所述的六种甜味剂为A-K糖、糖精钢、甜蜜素、阿斯己甜、纽甜和新 甲基澄皮巧二氨查耳酬NHDC;所述的检测方法包括：
[0007] (1)制备混合标准工作液，所述的混合标准工作液中甜味剂的浓度分别为O.Olmg/ ml、0.05mg/ml、0.1Omg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1.OOmg/ml;
[000引 （2)制备待测样品溶液，准确称取0.1 g样品于lOOmL容量瓶中，加入lOmL乙醇，超声 溶解10~15min，使难溶于水的组分充分溶解，再用水定容至lOOmL，摇匀，经0.45皿滤膜过 滤，滤液作为样品溶液；
[0009] (3)所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为紫外检测器VWD，检测波长为200皿，色 谱柱为反相C18，色谱柱溫度为30 ± rC ;流动相A为乙腊，流动相B为20mmol/L硫酸锭;梯度 洗脱程序为乙腊:〇 ~2min，5%;2 ~10min，5% ~10%;10 ~18min，10% ~50%;18 ~20min， 50%~5%;流速：1.〇1111/111111;
[0010] (4)所用前处理方法为加入乙醇，使样品中难溶于水的组分NHDC充分溶解，用水稀 释成Img/mL的溶液，用ο. 45WI1的微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品溶液，进样体积为
[0011] (5)标准曲线的绘制:将六种甜味剂的系列混合标准溶液注入高效液相色谱仪中， 在(3)的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，W保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小 与其浓度的对应关系绘制标准曲线；
[0012] (6)结果分析:取(2)中缩的的滤液，在(3)的色谱条件下进样分析，测得滤液中各 组分的峰面积，W保留时间定性，根据步骤(5)中制作的标准曲线定量，计算滤液中各甜味 剂的浓度，由此计算出待检测样品中甜味剂的含量。
[0013] 优选地，所述的混合标准工作液为现配现用，所述的混合标准工作液由混合标准 储备液稀释而来，分别准确量取0.10ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、10.00ml混合标准 储备液至10ml容量瓶中，用水定容后混匀得混合标准工作液。
[0014] 更优选地，所述的混合标准储备液的制备过程为：分别准确称取O.lOOOgA-K糖、 0.0851g糖精钢标准品、0. lOOOg甜蜜素、0. lOOOg阿斯己甜、0. lOOOg新甲基澄皮巧二氨查耳 酬标准品、O.lOOOg纽甜于100ml容量瓶中，加30%乙腊水溶液溶解后，定容至100.00ml，摇 匀。
[0015] 进一步优选地，所述的混合标准储备液于4°C条件下储藏，保存期为3个月。
[0016] 更进一步优选地，所述的反相C18色谱柱规格为250mm X 4.6mm，5皿。
[0017] 再进一步优选地，所述的流动相B中的硫酸锭用出Κ)4调抑至4.4。
[0018] 最优选地，所述的标准曲线的相关系数大于0.999。
[0019] 采用了该发明中的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的方法，本 发明的有益效果体现在：
[0020] (1)本发明建立了一种高效液相色谱仪同时检测饲用甜味剂中六种甜味剂的方 法，能够对饲用甜味剂中的甜味剂进行定性和定量，为饲用甜味剂成分和含量的准确判定 和快速检测提供科学依据。
[0021] (2)本发明中混合标准工作液中甜味剂的浓度分别为0.0 Img/ml、0.05mg/ml、 0.1 Omg/ml、0.20mg/ml、0.50mg/ml、1. OOmg/ml;能够一次性检测含量在 1 % ~100 % 之间的 任何浓度的甜味剂，适用于饲用甜味剂含量的检测。
[0022] (3)本发明中使用的分析仪器为高效液相色谱-紫外检测器，相对于超高压液相色 谱-飞行时间质谱仪、超高效液相色谱-Ξ重四级杆串联质谱仪等造价高昂的仪器，更加普 及，更利于检测方法的应用。
[0023] (4)本发明操作简单，检测结果准确可靠、重复性好，21分钟内即可完成六种甜味 剂含量的检测，检测效率高。
[0024] (5)本发明中反相018色谱柱与10~1911皿〇1凡硫酸锭（用出口〇4调抑=4.4)-乙腊流 动相的选择对饲用甜味剂中的六种甜味剂的分离达到了优异的分离效果(特别是糖精钢与 甜蜜素的分离），同时也减少了检测过程中检测试剂对环境造成的污染，检测人员安全性 局。
[0025] (6)本发明中样品的前处理加入乙醇并超声溶解，更利于难溶于水的组分的充分 溶解，更能保证检测结果的准确性。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明的高效液相色谱仪同时检测饲料添加剂中六种甜味剂的混合标准溶 液高效液相色谱图。
[0027] 图2为现有市售甜味剂样品溶液1的高效液相色谱图。
[00%]图3为现有市售甜味剂样品溶液2的高效液相色谱图。
[0029] 图4为现有市售甜味剂样品溶液3的高效液相色谱图。
[0030] 附图标记
[0031] 1 A-K 糖，保留时间 7.4min
[0032] 2甜蜜素，保留时间10.9min
[0033] 3糖精钢，保留时间12.3min
[0034] 4阿斯己甜，保留时间16.5min
[0035] 5新甲基澄皮巧二氨查耳酬，保留时间18.7min
[0036] 6纽甜，保留时间20.2min
[0037] 11 A-K糖
[0038] 12甜蜜素
[0039] 13糖精钢
[0040] 14新甲基澄皮巧二氨查耳酬
[0041 ] 15 纽甜
【具体实施方式】
[0042] 为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的 描述。
[0043] 实施例1:市售某巧巾饲用甜味剂的检测
[0044] 1.试剂和材料
[0045] 除非有特殊说明，本测定方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级 水。
[0046] 1.1甲醇:色谱纯
[0047] 1.2乙睛:色谱纯 [004引1.3硫酸锭:优级纯
[0049] 1.4A-K糖标准品：98.0%，东京化成工业株式会社
[(K)加]1.5糖精钢标准品：99.0% ,Ογ.Ε；虹enstorfer公司，德国
[0化1 ] 1.6甜蜜素标准品:98.0%，东京化成工业株式会社
[0化^ 1.7阿斯己甜标准品：98.0%，东京化成工业株式会社
[0化3] 1.8新甲基澄皮巧二氨查耳酬标准品：98.0%，〔顺了0油11〇1〇邑1636111地，德国
[0化4] 1.9纽甜标准品:98.0%，东京化成工业株式会社
[005引1.10混合标准品储备液:分别准确称取0. lOOOgA-K糖（1.4)、0.0851g糖精钢标准 ((1.5)，120°(：下烘干地）、0.1000邑甜蜜素（1.6)、0.1000邑阿斯己甜（1.7)、0.1000邑新甲基澄 皮巧二氨查耳酬标准品（1.8)、0. lOOOg纽甜（1.8)于100ml容量瓶中，加30%乙腊水溶液溶 解后，定容至100.00ml，摇匀，此混合标准品储备液中六种甜味剂的浓度均为l.OOmg/ml。此 溶液4 °C条件下储藏，保存期3个月。
[0056] 1.11混合标准品工作液:分别准确量取0.10ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、5.00ml、 10.00ml混合标准储备液(1.10)至10ml容量瓶中，用水定容，混匀，此为混合标准工作液。混 合标准工作液中甜味剂的浓度分别为0 . Olmg/ml、0.05mg/ml、0 . lOmg/ml、0.20mg/ml、 0.50mg/ml、1. OOmg/ml。此溶液现配现用。
[0化7] 2.仪器和设备
[005引2.1实验室常用仪器设备
[0059] 2.2分析天平:感量0.0001邑
[0060] 2.3水性微孔滤膜:孔径0.45μπι
[0061] 2.4有机相微孔滤膜:孔径0.45皿
[0062] 2.5高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
[0063] 2.6超声波清洗器
[0064] 2.7具塞塑料离屯、管：1