同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的hplc方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及藏药材质量控制方法技术领域，具体涉及同时测定小檗皮中四种生物 碱成分含量的HPLC方法。
【背景技术】
[0002] 藏药小檗皮始载于《四部医典》，藏文译音"吉尔哇"、"杰星"等，来源于小檗科植物 甘肃小檗Berberis kansuensis Schneid.及同属数种植物的干燥内皮。小檗皮具有清热解 毒、排黄水等功效，是常用的藏药材，也是八味小檗皮散、四味姜黄汤散等藏药复方制剂的 主要组成药味，可用于治疗黄水病、尿路感染、眼病等疾病，具有较好的开发利用价值。因 此，检测小檗皮药材中有效成分的含量，对小檗皮药材的质量进行监控，具有十分重要的现 实意义。
[0003] 小檗皮药材的有效成分主要为生物碱类化合物，如小檗碱、木兰花碱、巴马汀和药 根碱等。目前已有文献(子巴，HPLC法测定不同产地藏药小檗皮中盐酸小檗碱含量比较[J]. 四川中医，2011,29(9):45-46.;张琦等，藏药小檗皮中小檗碱的含量测定[J].中国民族医 药杂志，2000,6(3) :41-42.)报道测定了藏药小檗皮中小檗碱的含量。
[0004] 然而，考虑到小檗皮药材中的有效成分繁多，以单一有效成分含量作为质量标准 的指标可靠性不高。同时，目前小檗皮药材的用药部位界定不清，使用较为混乱：《部颁标 准?藏药分册》规定为干燥内皮，但并没有明确指明是那个部位的内皮;六省区卫生局制订 的《藏药标准》规定为茎或根的内皮;而且市场调研也发现有藏药材市场和饮片企业仍然销 售带有栓皮的小檗皮药材的情况。用药部位的混乱必然影响药材的质量，如果不知道小檗 皮不同部位中各个有效成分含量的差异，在临床上混乱使用，也对小檗皮的安全性和临床 疗效的稳定性造成了极大的隐患。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供了一种同时测定小檗皮中四种生物碱成分含量的 HPLC方法，所述四种生物碱成分为木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱，包括以下步骤：
[0006] (1)制备供试品溶液：
[0007] 取小檗皮粉末，加以盐酸-甲醇作为提取溶剂提取，过滤得供试品溶液;其中，所述 盐酸与甲醇的体积比为1:200~1:50;
[0008] (2)制备对照品溶液：
[0009] 取木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品，混合，加甲醇配制成 混合对照品溶液；
[0010] (3)分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
[0011] 色谱柱:Ci8色谱柱；
[0012] 流动相:流动相A为乙腈，流动相B为0.2 %磷酸水溶液，梯度洗脱程序为0~10分 钟，17% ~19%A; 10~11 分钟，19% ~28%A; 11~18 分钟，28% ~34%A; 18~25 分钟，34% ~34%A;
[0013] (4)根据检测结果计算得到小檗皮中的木兰花碱、药根碱、巴马汀和小檗碱含量。
[0014] 进一步地，步骤(1)中，所述甲醇的浓度为70%，盐酸的浓度为36~37%。
[0015] 进一步地，步骤(1)中，所述提取是超声或回流提取。
[0016] 进一步地，所述提取的时间是30分钟。
[0017]进一步地，步骤（1)中，所述样品重量与提取溶剂的质量体积比为60-120g/mL，优 选的质量体积比为1 〇〇g/mL。
[0018] 进一步地，步骤(1)中，所述盐酸与甲醇的体积比为1:100。
[0019] 进一步地，步骤⑶中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μ m〇
[0020] 更进一步地，所述色谱柱为InertSustain Ci8色谱柱。
[0021 ] 进一步地，所述色谱条件的柱温为25°C~35°C ;流速为1 .OmL/min。
[0022] 进一步地，所述小檗皮的基源品种为鲜黄小檗Berberis diaphana、匙叶小檗 Berberis vernae或甘肃小檗Berberis kansuensis。
[0023 ]进一步地，所述小檗皮的部位为茎木、茎内皮、莖栓皮、根木、根内皮或根栓皮。
[0024] 由于中国食品药品检定研究院提供的法定对照品只有盐酸小檗碱、盐酸药根碱和 盐酸巴马汀，因此参照《中国药典》2015版一部"黄柏"药材中小檗碱的HPLC含量测定方法 (国家药典委员会.中国药典2015年版一部.北京：中国医药科技出版社，2015，305)，本发明 实际测定的药根碱含量是以盐酸药根碱计，巴马汀含量是以盐酸巴马汀计，小檗碱含量是 以盐酸小檗碱计。
[0025] 本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定小檗皮中四种生 物碱成分一一木兰花碱、巴马汀、药根碱和小檗碱含量的HPLC方法，该方法准确可靠、简便 快速，为提高小檗皮的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方 法还准确检测出了不同基源品种不同部位中四种生物碱成分，为小檗皮的临床应用提供了 有效的参考。
[0026] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0027]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0028]图1-4依次为木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的紫外光谱图。 [0029]图5为流动相为乙腈-0.02m〇L/L磷酸二氢钾溶液时样品色谱峰的分离情况。
[0030]图6为流动相为乙腈-水溶液时样品色谱峰的分离情况。
[0031]图7为流动相为乙腈-0.2 %磷酸溶液时样品色谱峰的分离情况。
[0032] 图8流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液时样品色谱峰的分离情况。
[0033] 图9为在梯度洗脱条件1下样品色谱峰的分离情况。
[0034] 图10为在梯度洗脱条件2下样品色谱峰的分离情况。
[0035] 图11为在梯度洗脱条件3下样品色谱峰的分离情况。
[0036] 图12为在梯度洗脱条件4下样品色谱峰的分离情况。
[0037] 图13为在梯度洗脱条件5下样品色谱峰的分离情况。
[0038] 图14为小檗皮HPLC图谱(60min)。
[0039] 图15为柱温为25 °C时样品色谱峰的分离情况。
[0040] 图16为柱温为30°C时样品色谱峰的分离情况。
[0041]图17为柱温为35°C样品色谱峰的分离情况。
[0042] 图 18为InertSustain Cis色谱柱（4·6X250mm，5μm，S/N:4GR98105，C/N:5020-07346)下的色谱图。
[0043] 图19为1仙『8^1005-3色谱柱（250\4.6臟，54111，511厶7143038，(：/^:5020-01732)下的色谱图。
[0044] 图20为WondaSil Cis-WR色谱柱（250X4·6mm，5μm，SN:3D5701-15，C/N:5020-39033)下的色谱图。
[0045] 图21为混合对照品溶液(A)和小檗皮样品溶液(B)的HPLC色谱图，峰1为木兰花碱； 峰2为盐酸药根碱;峰3为盐酸巴马汀;峰4为盐酸小檗碱。
[0046] 图22为小檗皮不同药用部位的HPLC色谱图，峰1为木兰花碱;峰2为盐酸药根碱;峰 3为盐酸巴马汀;峰4为盐酸小檗碱。
[0047] 图23为小檗皮不同部位中四种生物碱成分及总生物碱含量的比较:数据以平均值 土标准偏差表示。根据方差分析和Tukey s多重比较，误差棒上相同的字母表示组间没有显 著性差异，而不同的字母则表示组间具有显著性差异(P〈〇.05)。
【具体实施方式】 [0048]仪器与试药：
[0049] 美国Agilent 1200高效液相色谱仪，配置二极管阵列（DAD)检测器；Sartorius BP121s电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；CQ-250超声波清洗器(上海必能信有 限公司）。
[0050] 盐酸药根碱(批号110733-201108)、盐酸巴马汀(批号11073-201108)、盐酸小檗碱 (批号0713-9605)均购于中国食品药品检定研究院，木兰花碱购于成都曼思特生物科技有 限公司（批号MUST-14122416,含量>98% )，乙腈为色谱纯(Fisher)，水为超纯水，盐酸为浓 度36~37 %的市售盐酸，其余试剂均为分析纯。
[0051] 18批小檗皮药材，其中8批商品药材从各地藏医药或药材市场收集，另10批药材均 为野外实地采集，分别为小檗科植物鲜黄小檗(Berberis diaphana)、匙叶小檗(Berberis vernae)和甘肃小檗(Berberis kansuensis)具体如下所不：
[0052] _
[0053] 实施例1本发明方法的工艺参数筛选