基Iml加到人型支原体、解尿支原体标准菌株冻干粉中，溶解后，分别用移液器吸取支原体菌液分别加到10瓶肺炎支原体液体培养基、10瓶人型支原体液体培养基、10瓶解尿支原体液体培养基，每瓶分别加ΙΟΟμΙ，经培养成阳性反应后，每种将9瓶置一25°0冰箱作种子保存，一瓶用作二级扩增培养，每瓶扩增成10瓶，呈阳性反应后收获，于4°C冰箱保存，以备用作免疫原菌液。
[0150]Ba I b/C小鼠的免疫:8周龄的Ba I b/C小鼠20只，分成2组，每组1只，将种作免疫原的支原体菌株的浓度调到105/ml，置50°C恒温箱30分钟灭活，和等量完全佐剂混合后，以每只0.2ml的量，腹腔注射分别免疫Balb/C小鼠。于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合。
[0151]细胞融合:
[0152](I)免疫脾细胞的制备:
[0153]①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
[0154]②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液到30ml，混匀后，经100rpm离心5分钟，弃去上清。
[0155]③用不完全培养液将沉淀细胞再离心、洗涤一次(重复步骤②)，将沉淀的细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数版计数。总细胞数调为I X ΙΟ8。
[0156](2)sp20骨髓瘤细胞悬液的制备
[0157]①将sp20骨髓瘤细胞进行扩增培养。
[0158]②将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml的离心管内。
[0159]③100rpm离心5分钟，弃去上清。
[0160]④加入30ml不完全培养液，重复步骤③，再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至1ml,混匀，计数。总细胞数调为3 XlO70
[0161](3)细胞融合
[0162]①分别吸取含IX 18个脾细胞悬液和3 X 17个骨髓瘤细胞悬液，加入50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇勾。
[0163]②100rpm离心7分钟，弃去上清。
[0164]③加50%的融合剂聚乙二醇(PEG)0.7ml。
[0165]④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
[0166]⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
[0167]⑥加入20ml含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的选择性培养液(HAT培养液)，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
[0168]⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，在37 °C含5 %⑶2的孵箱中培养。
[0169](4)抗体阳性孔检测一间接ELISA法
[0170]①用已知支原体抗原菌液包被
[0171]②加有克隆生长的孔中的培养上清ΙΟΟμΙ。
[0172]③加酶标抗鼠IgG抗体ΙΟΟμΙ。
[0173]④加底物液ΙΟΟμΙ，室温避光显色20分钟。
[0174]⑤判定结果:在酶联免疫检测仪492波长下测定OD值，空白对照调零。若待测控OD值大于或等于阴性对照孔OD值2.1倍，则可判定为阳性孔，孔内生长有阳性克隆。
[0175](5)克隆化一有限稀释法
[0176]将96孔板中培养上清被检测为抗体阳性的孔标记出来。用加样器将孔内的杂交瘤细胞反复吹打均匀后计数，然后用有限稀释法进行逐级稀释，再加到96孔板进行培养。观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测。将阳性克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养。
[0177](6)杂交瘤细胞的冻存
[0178]将呈对数生长的杂交瘤细胞收集于离心管，100rpm离心10分钟，弃去上清，加入Iml冻存液混匀，然后加到冻存管，在一 70°C低温冰箱过夜后转入液氮罐长期保存。
[0179](7)腹水型单克隆抗体制备
[0180]将冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，100rpm离心10分钟，收集上清备用。加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞数为I X1Vml^只Balb/C小鼠腹腔注射0.5ml，接种杂交瘤细胞后14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水离心，收集上清即为腹水型单克隆抗体，分装后置一 20°C冰箱，冻存备用。
[0181](8)单克隆抗体的鉴定
[0182]支原体单克隆抗体筛选到11株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1厶6、比3、2?5、268、3?8、4々3、482、4!15、502、5?7、603。经效价测定:以上6种腹水型单克隆抗体的效价为I X 10一7。经交叉反应测定3F8、4H5杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体除解尿支原体、人型支原体外不与其它支原体发生交叉反应。以4H5株单克隆抗体细胞株制备的单克隆抗体作为本发明检测用单克隆抗体。
[0183]2、腹水型淋病奈瑟氏菌单克隆抗体的制备
[0184]菌种:淋病奈瑟氏菌由美国ATCC公司提供，以上菌株用作免疫原产生单克隆抗体。
[0185]细胞株:SP20小鼠骨髓瘤细胞株由第四军医大学细胞工程研究中心提供，作细胞融合用。
[0186]方法:
[0187]免疫原支原体菌株的制备和灭活:将淋病奈瑟氏菌扩增培养后，用培养液稀释至108/ml，于4°C冰箱保存，以备用作免疫原菌液。
[0188]Balb/C小鼠的免疫:8周龄的Balb/C小鼠10只，将种作免疫原的支原体菌株液离用离心机2000r/m离心10分钟，弃上清，细菌样品中加入I %甲醛溶液，混匀固定24小时灭活，生理盐水洗涤三次，用生理盐水将菌株浓度调到107/ml，以每只0.5ml的量，腹腔注射分别免疫Balb/C小鼠。于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合。
[0189]细胞融合:
[0190](I)免疫脾细胞的制备:
[0191]①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
[0192]②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液到30ml，混匀后，经100rpm离心5分钟，弃去上清。
[0193]③用不完全培养液将沉淀细胞再离心、洗涤一次(重复步骤②)，将沉淀的细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞计数版计数。总细胞数调为I X 108。
[0194](2)sp20骨髓瘤细胞悬液的制备
[0195]①将sp20骨髓瘤细胞进行扩增培养。
[0196]②将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml的离心管内。
[0197]③100rpm离心5分钟，弃去上清。
[0198]④加入30ml不完全培养液，重复步骤③，再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至1ml,混匀，计数。总细胞数调为3 XlO70
[0199](3)细胞融合
[0200]①分别吸取含IX 18个脾细胞悬液和3 X 17个骨髓瘤细胞悬液，加入50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇勾。
[0201]②100rpm离心7分钟，弃去上清。
[0202]③加50%的融合剂聚乙二醇(PEG)0.7ml。
[0203]④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
[0204]⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
[0205]⑥加入20ml含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的选择性培养液(HAT培养液)，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
[0206]⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，在37°C含5%⑶2的孵箱中培养。
[0207 ] (4)抗体阳性孔检测一间接ELI SA法
[0208]①用已知淋病奈瑟氏菌液包被
[0209]②加有克隆生长的孔中的培养上清ΙΟΟμΙ。
[0210]②加酶标抗鼠IgG抗体ΙΟΟμΙ。
[0211 ] ③加底物液ΙΟΟμΙ，室温避光显色20分钟。
[0212]⑤判定结果:在酶联免疫检测仪492波长下测定OD值，空白对照调零。若待测控OD值大于或等于阴性对照孔OD值2.1倍，则可判定为阳性孔，孔内生长有阳性克隆。
[0213](5)克隆化一有限稀释法
[0214]将96孔板中培养上清被检测为抗体阳性的孔标记出来。用加样器将孔内的杂交瘤细胞反复吹打均匀后计数，然后用有限稀释法进行逐级稀释，再加到96孔板进行培养。观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测。将阳性克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养。
[0215](6)杂交瘤细胞的冻存
[0216]将呈对数生长的杂交瘤细胞收集于离心管，100rpm离心10分钟，弃去上清，加入Iml冻存液混匀，然后加到冻存管，在一 70°C低温冰箱过夜后转入液氮罐长期保存。
[0217](7)腹水型单克隆抗体制备
[0218]将冻存的杂交瘤细胞复苏扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞吹打下来，100rpm离心10分钟，收集上清备用。加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞数为I X10%1_只Balb/C小鼠腹腔注射0.5ml，接种杂交瘤细胞后14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水离心，收集上清即为腹水型单克隆抗体，分装后置一 20°C冰箱，冻存备用。
[0219](8)单克隆抗体的鉴定
[0220]淋病奈瑟氏菌单克隆抗体筛选到4株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A2、1C6、1G8、2D5。经效价测定:以上6种腹水型单克隆抗体的效价为1X10—7。经交叉反应测定1C6、1G8杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体除淋病奈瑟氏菌外不与其它支原体发生交叉反应。以1C6株单克隆抗体细胞株制备的单克隆抗体作为本发明检测用单克隆抗体。
[0221]3、腹水型白色念珠菌单克隆抗体的制备
[0222]菌种:白色念珠菌由美国ATCC公司提供，以上菌株用作免疫原产生单克隆抗体。
[0223]细胞株:SP20小鼠骨髓瘤细胞株由第四军医大学细胞工程研究中心提供，作细胞融合用。
[0224]方法:
[0225]免疫原支原体菌株的制备和灭活:将白色念珠菌扩增培养后，用培养液稀释至108/ml，于4°C冰箱保存，以备用作免疫原菌液。
[0226]Balb/C小鼠的免疫:8周龄的Balb/C小鼠10只，将种作免疫原的支原体菌株液离用离心机2000r/m离心10分钟，弃上清，细菌样品中加入I %甲醛溶液，混匀固定24小时灭活，生理盐水洗涤三次，用生理盐水将菌株浓度调到107/ml，以每只0.5ml的量，腹腔注射分别免疫Balb/C小鼠。于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合。
[0227]细胞融合:
[0228](I)免疫脾细胞的制备:
[0229]①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
[0230]②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液到30ml，混匀后，经100rpm离心5分钟，弃去上清。
[0231]③用不完全培养液将沉淀细胞再离心、