一种消炎片hplc指纹图谱构建方法
【专利摘要】一种消炎片HPLC指纹图谱构建方法，包括：（1）供试品溶液，消炎片研细，称定，置提取器中，加石油醚热回流提取，弃石油醚，加甲醇，超声处理，补甲醇，滤过；（2）对照品溶液：取绿原酸、秦皮乙素、黄芩苷、蒙花苷、黄芩素、汉黄芩素对照品，以甲醇为溶剂配制混合对照品溶液；（3）测定：分别取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，记录120分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得消炎片的指纹图谱。本发明的积极效果是：本发明建立了消炎片 HPLC特征指纹图谱共有模式，标定了27个共有峰，能有效的表征其质量，克服了原质量控制方法的单一性和片面性，具有较高的应用价值。
【专利说明】
一种消炎片HPLC指纹图谱构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及采用高效液相色谱法建立消炎片的高效液相指纹 图谱用于消炎片的质量控制。
【背景技术】
[0002] 中药指纹图谱是指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段和仪器检测得到 的，能够标示该中药及其制剂中的各种组分群体特性的共有峰的图谱。通过指纹图谱整体 特征峰的相对保留时间及含量或比例的制定和比对，可有效地控制中药材及中药产品质 量，保证产品质量的相对稳定。目前最常采用的制备中药指纹图谱的检测方法有光谱法和 色谱法。光谱方法如紫外光谱和红外光谱在实际应用中能提供识别的信息较少，往往当同 类化合物其取代基团发生变化时，对应的光谱却难以体现出来，一般不采用。色谱方法中薄 层色谱(TLC)、气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)技术已成为3种公认常用的指纹图谱分 析手段，其中特别又以HPLC分离效率高、分析速度快、样品适应性广、检测器种类多、灵敏度 高、稳定性、重复性好而备受推崇，成为制备指纹图谱的首选方法。
[0003] 目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段。在我 国中药注射剂现已强制实行中药指纹图谱质量标准的指标，银杏叶注射剂、清开灵注射剂、 广炎灵注射剂、红景天注射剂、青银注射剂、鱼金注射剂、肿节风注射剂等已相继建立了指 纹图谱的质量标准用于控制产品的质量。
[0004]上呼吸道感染是指自鼻腔至喉部之间的急性炎症的总称，是最常见的感染性疾 病。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播。 常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。临床治疗存 在"治必输液"、"治必激素"、"治必抗菌"的三大误区，造成抗菌素滥用，加重了患者的经济 负担，还易引起内正常的菌群失调，产生众多隐患。更可怕的是，一旦用了如此强烈的药，病 菌一旦产生耐药性，以后使用较温和的药很难达到疗效了。
[0005] 在祖国医学中上呼吸道感染通称"伤风感冒"，根据临床表现，可分为风寒感冒和 风热感冒两型。风寒感冒型治以辛温解表法。风热感冒型治以辛凉解表，清热解毒法。
[0006] 消炎片是由蒲公英(446g)、紫花地丁 (446g)、野菊花(446g)、黄芩(446g)组成，是 修正药业集团股份有限公司多年来重点培育的中药大品种，具有抗菌消炎的功能，临床上 用于治疗呼吸道感染，发热，肺炎，支气管炎，咳嗽有痰，疖肿等具有良好的疗效。由于其组 方清楚合理，临床疗效良好，市场需求量大，自上市以来销售收入逐年上升，2012年销售收 入已经达到6000万元。
[0007] 虽然其临床疗效好，但由于消炎片原收载于部颁标准，与其他传统中成药品种一 样，其传统的生产工艺和质量标准使该品种存在着制备工艺不合理、质量标准低(无含量测 定项等）、检测指标少、服用量大、药效物质及机制不清等问题，限制了该产品用药人群及市 场份额。因此，对消炎片的提取精制方法、质量控制方法进行改进成为人们积极研究的课 题。
[0008] 目前，主要是采用对方中药味进行鉴别或者增加对某种单一成分进行含量测定的 方法来提高消炎片的质量标准。如采用HPLC法测定消炎片中黄芩苷含量(张帅等，HPLC测定 不同厂家消炎片中黄芩苷含量，中成药，抗老年性痴呆天然产物研究进展，沈阳药科大学学 报，2007年，第29卷，第6期，926页）；采用HPLC法测定消炎片中蒙花苷的含量（陈立柱等， HPLC法测定消炎片中蒙花苷的含量，中国药师，2011年，第14卷，第11期，1601页）；采用HPLC 法测定秦皮乙素的含量(黄艳萍，HPLC法测定消炎片中秦皮乙素的含量，黑龙江医药，2009 年，第22卷，第1期，10页）。也有采用HPLC法同时测定两种成分的报道(HPLC法同时测定消炎 片中绿原酸和秦皮乙素的含量，药品鉴定，2011年，第8卷，第11期，54页）。上述的方法都是 用一味两味成分来说明消炎片的内在质量，具有一定的片面性。要控制消炎片的质量，只针 对其中一两个化学成分进行表征和控制是不够的，必须对它的物质群整体予以控制。所以， 除了微观分析外，还应该用某种宏观分析的方法，从整体上有效的表征中药质量。指纹图谱 作为中草药及其制剂的质量控制方法，目前已经成为业内人士的共识。在本发明之前，以消 炎片的含有的化成分为指标建立指纹图谱的方法未见报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于，提供一种消炎片的指纹图谱检测方法及其指纹图谱，通过此 方法可以较为全面地控制消炎片的质量，从而更好地保证消炎片的质量稳定性、一致性和 可控性，从而确保消炎片的安全性和有效性。
[0010] 本发明中所述的消炎片由蒲公英446g、紫花地丁446g、野菊花446g、黄芩446g制备 而成。具体的制备方法为:除黄芩粉碎成细粉外，其余蒲公英等三味加水煎煮二次，第一次3 小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液，浓缩成稠膏，与黄芩粉末混匀，干 燥，粉碎，过筛，用65%乙醇制粒，压制成1000片，即得。
[0011] 本发明采用如下的技术方案:一种消炎片的指纹图谱检测方法，采用高效液相色 谱法测定其指纹图谱。
[0012] 具体的，所述的消炎片的指纹图谱检测方法包括以下步骤：
[0013] (1)供试品溶液的制备：取消炎片，研细，取0.1~0.5g，精密称定，置索氏提取器 中，加石油醚(60~90°C)50~150mL，加热回流0.5~3小时，弃去石油醚液，药渣挥去石油 醚，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20~70mL，密塞，称定重量，超声处理（功率160W，频率 50kHz) 20~40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供 试品溶液；
[0014] (2)对照品溶液的制备:分别精密称取绿原酸、秦皮乙素、黄芩苷、蒙花苷、黄芩素、 汉黄芩素对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成质量浓度分别为〇. 05、0.05、0.50、 0.05、0.05、0.02mg/mL的混合对照品溶液，过0.45_的微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶 液；
[0015] (3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5~20yl，注入高效液相色谱 仪，记录120分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得消炎片的指纹图谱。
[0016] 前述方法中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1 %甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速0.5~1.5ml/min， 柱温28~42°C，检测波长210~350nm;理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3500。
[0017] 优选的，所述的消炎片的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
[0018] (1)供试品溶液的制备:取消炎片，研细，取约0.3g，精密称定，置索氏提取器中，加 石油醚（60~90°C )50mL，加热回流1小时，弃去石油醚液，药渣挥去石油醚，置具塞锥形瓶 中，精密加甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率50kHz) 30分钟，放冷，再称 定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0019] (2)对照品溶液的制备:分别精密称取绿原酸、秦皮乙素、黄芩苷、蒙花苷、黄芩素、 汉黄芩素对照品适量，精密称定，置于同一5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再 精密吸取lmL置于同一 10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为 0 ? 049、0 ? 052、0 ? 532、0 ? 044、0 ? 045、0 ? 022mg/mL 的混合对照品溶液，过0 ? 45_ 的微孔滤膜， 取续滤液作为对照品溶液；
[0020] (3)测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各lOiil，注入高效液相色谱仪， 记录120分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得消炎片的指纹图谱。
[0021] 所述高效液相色谱测定的色谱条件优选为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 以乙腈为流动相A，以0.1 %甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30°C，检测 波长321nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3500。
[0022] 前述的消炎片的指纹图谱检测方法中，梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化 为：0~30min，7% ~10%A;30~45min，10% ~15%A;45~60min，15%A;60~70min，15% ~ 25%A;70~80min，25%~35%A;80~90min，35%~45%A;90~100min，45%~55%A;100 ~110min，55% ~65%A;110 ~115min，65% ~7%A;115 ~120min，7%A。具体洗脱比例见表 1〇
[0023] 如前述消炎片的指纹图谱检测方法得到的消炎片指纹图谱，所述图谱中有27个共 有峰。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0025] 1、本发明所提供的方法建立的消炎片HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度均大于 0.9,能有效的表征其质量，有利于全面监控产品的质量；
[0026] 2、本发明建立了消炎片HPLC特征指纹图谱，标定了 27个共有峰，建立的指纹图谱 技术含量高，避免了消炎片质量控制的单一性和片面性，减少了人为处理产品质量达标的 可能性；
[0027] 3、由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的 信息，因此，本发明选择在321nm波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息较完全;各个峰 吸收值良好，基线平稳，也避免了近紫外杂质峰较大吸收情况；
[0028] 4、本发明方法所得消炎片指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可 与巨〇
【附图说明】
[0029] 图1混标HPLC色谱图；
[0030]图2是本发明测得的消炎片的共有模式图谱；
[0031]图3是11个批次消炎片指纹图谱叠加图。
【具体实施方式】
[0032]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明消炎片的HPLC指 纹图谱建立及其指纹图谱作进一步的说明。
[0033]本发明的实施例1:检测不同批次消炎片的指纹图谱 [0034] 1仪器与试药
[0035] 1.1 Agilent 1220型高效液相色谱仪(美国安捷伦）；KQ-100型超声波清洗器（昆 山市超声仪器有限公司）；RE_98型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂）；124S电子天平(北京 赛多利斯天平有限公司）。
[0036] 1.2纯净水(娃哈哈），乙腈(色谱纯），其他试剂均为分析纯。绿原酸、秦皮乙素、黄 芩苷、蒙花苷、黄芩素、汉黄芩素对照品（批号110753-200413、110741-200506、110715-201016、111528-200606、111595-200905、111514-200403,中国食品药品检定研究院）。消炎 片（批号：150301、150302、150303、150304、150305、150601、150801、150802、150803、 150804、150805，修正药业集团股份有限公司）。
[0037] 2指纹图谱的测定
[0038] 2.1色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.1%甲 酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0ml/min，柱温30°C，检测波长32lnm，理论塔板数按黄 芩苷峰计算应不低于3500。
[0039]流动相梯度洗脱程序见表1:
[0040]表1流动相梯度洗脱比例
[0042] 2.2供试品溶液的制备:取消炎片，研细，取约0.3g，精密称定，置索氏提取器中，加 石油醚（60~90°C )50mL，加热回流1小时，弃去石油醚液，药渣挥去石油醚，置具塞锥形瓶 中，精密加甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率160W，频率50kHz) 30分钟，放冷，再称 定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0043] 2.3对照品溶液的制备:分别精密称取绿原酸秦皮乙素、黄芩苷、蒙花苷、黄芩素、 汉黄芩素对照品适量，精密称定，置于同一5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再 精密吸取lmL置于同一lOmL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为 0 ? 049、0 ? 052、0 ? 532、0 ? 044、0 ? 045、0 ? 022mg/mL 的混合对照品溶液，过0 ? 45_ 的微孔滤膜， 取续滤液作为对照品溶液；
[0044] 2.4测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10yl，注入高效液相色谱仪， 记录120分钟内的色谱图。分别见图1、图2。
[0045] 2.5共有峰确定:通过11批消炎片指纹图谱测定，比较其色谱图，标记出27个共有 峰，共有峰面积总和占所有峰总面积90%以上。其中4号峰为绿原酸、5号峰为秦皮乙素、11 号峰为黄芩苷(S)、15号峰为蒙花苷、22号峰为黄芩素、24号峰为汉黄芩素。
[0046] 2.6方法学考察
[0047] 2.6.1精密度考察:分别以同一批消炎片供试液，按上述色谱条件连续进样6次，考 察仪器的精密度，分别计算共有峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD)，结果RSD (%)未超过2 %，表明仪器精密度良好。
[0048] 2.6.2稳定性考察:分别以同一批消炎片供试液，按上述色谱条件于0、4、8、12、241! 进样分析，计算共有峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果RSD( %)未超过 2 %，表明供试液较为稳定。
[0049] 2.6.3重现性考察:取同一批次消炎片成品6份，按2.2项下方法制备供试品溶液， 按上述色谱条件进行色谱分析，分别计算共有峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD)，结果RSD( % )未超过2%，表明此方法重复性好。
[0050] 实施例2:11批次消炎片的指纹图谱的测定与数据分析
[0051]取11批消炎片，按实施例1条件进行检测，得11批样品的HPLC图谱。如图3。
[0052]通过对11批PHLC图谱的比较，进行相似度评价，确定其特征共有峰:将11批消炎片 的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版（国家药典委员会），采用共有 峰模式，设定时间窗宽度为O.lmin，以平均数法生成标准指纹图谱，确定了27个共有峰。11 批消炎片的相似度均大于0.9,见表3。27个共有峰相对保留时间基本一致，而相对峰面积存 在较大差别。
[0053]表 3
【主权项】
1. 一种消炎片HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 供试品溶液的制备:取消炎片，研细，取O . 1~O . 5g，精密称定，置索氏提取器中，加 沸点为60~90 °C的石油醚50~150mL，加热回流0.5~3小时，弃去石油醚液，药渣挥去石油 醚，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20~70mL，密塞，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再 称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液； (2) 对照品溶液的制备:分别精密称取绿原酸、秦皮乙素、黄芩苷、蒙花苷、黄芩素、汉黄 芩素对照品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成质量浓度分别为0.05、0.05、0.50、0.05、 0.05、0.02mg/mL的混合对照品溶液，过0.45μπι的微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液； (3) 测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5~20μ1，注入高效液相色谱仪，记 录120分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得消炎片的指纹图谱。2. 根据权利要求1所述的一种消炎片HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，所述高效液 相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相Α，以0.1 % 甲酸溶液为流动相8，梯度洗脱，流速0.5~1.51111/1^11，柱温28~42°(：，检测波长210~ 350nm;理论塔板数按黄苳苷峰计算应不低于3500。3. 根据权利要求1所述的一种消炎片HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于:包括以下步 骤： (1) 供试品溶液的制备:取消炎片，研细，取〇.3g，精密称定，置索氏提取器中，加沸点为 60~90°C的石油醚50mL，加热回流1小时，弃去石油醚液，药渣挥去石油醚，置具塞锥形瓶 中，精密加甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液； (2) 对照品溶液的制备:分别精密称取绿原酸、秦皮乙素、黄芩苷、蒙花苷、黄芩素、汉黄 芩素对照品适量，精密称定，置于同一5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密 吸取ImL置于同一IOmL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为 0 · 049、0 · 052、0 · 532、0 · 044、0 · 045、0 · 022mg/mL 的混合对照品溶液，过0 · 45μπι 的微孔滤膜， 取续滤液作为对照品溶液； (3) 测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ1，注入高效液相色谱仪，记录 120分钟内的色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得消炎片的指纹图谱。4. 根据权利要求3所述的一种消炎片HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于:所述高效液 相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为:ACE 5 C18-AR 250 X 4.60mm;以乙腈为流动相Α，以0.1 %甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速1.0 ml/min， 柱温30°C，检测波长321nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3500。5. 根据权利要求2或4所述的一种消炎片HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于:梯度洗 脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0~30min，7%~10%A;30~45min，10%~15%A;45~ 60min，15%A;60~70min，15%~25%A;70~80min，25%~35%A;80~90min，35%~45% A;90 ~100min，45% ~55%A;100 ~110min，55%~65%A;110~115min，65%~7%A;115~ 120min,7%A〇
【文档编号】G01N30/02GK105911161SQ201610221616
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】白冰, 徐建, 高丽娟, 祁树贤, 赫玉芳, 南敏伦, 赵昱玮
【申请人】吉林修正药业新药开发有限公司, 修正药业集团股份有限公司