血清或血浆中25-羟基维生素d液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种血清或血浆中25?羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：(1)样本前处理：往离心管内加入内标溶液10μl和人血清200μl，混合均匀，然后加600μl丙酮，混合均匀，低温静置15分钟后置于离心机上，以13000rpm转速离心5分钟；取上清液于第二离心管中，50℃氮气吹干后加入200μl乙腈复溶，混合均匀后置于离心机上，以13000rpm转速离心2?4分钟，取上清液；(2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式。本发明通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批量处理。
【专利说明】
血清或血浆中25-羟基维生素 D液相色谱串联质谱检测方法及 试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及25-羟基维生素D检测的技术领域，特别涉及一种改良的液相色谱串联 质谱法检测25-羟基维生素D。
【背景技术】
[0002] 近十年来，大量研究显示维生素D在健康和疾病中发挥重要作用（Ho lick MF.Deficiency of sunlight and vitamin D.BMJ 2008；336:1318-9.Holick MF,Chen TC.Vitamin D deficiency:a worldwide problem with health consequences.Am J Clin Nutr 2008;87:10803-63.)。维生素0不仅与佝偻病、骨质疏松等密切相关，与癌症、高 血压、糖尿病、多发性硬化症、抑郁等也存在关系（Holick MF.Vitamin D deficiency.N Engl J Med2007; 357:266-81.)。研究显示幼年时期维生素D水平与童年晚期或者成年时期 的许多紊乱疾病存在联系（McGrath J.Does'imprinting'with low prenatal vitamin D contribute to the risk of various adult disorders?Med Hypotheses 2001；56:367-71.)，例如研究显示，胎儿期低维生素D水平不仅与新生儿股骨长度有关(Morley R，Carlin JB,Pasco JA,ffark JD.Maternal25-hydroxyvitamin D and parathyroid hormone concentrations and offspring birth size.J Clin Endocrinol Metab 2006;91:906-12.)，还会在9岁时降低骨密度（Javaid MK,Crozier SR,Harvey NC,et al .Maternal vitamin D status during pregnancy and childhood bone mass at age 9years:a longitudinal study .Lancet 2006;367:36-43.)。鉴于维生素D水平与健康息息相关，其水 平的评估也越来越引起关注。25-羟基维生素D是维生素D的稳定代谢物，能够准确评估维生 素D的水平。传统的维生素D检测方法是一些放射免疫的方法，由于存在蛋白交叉反应，定量 不准确。有文献报道维生素D2和D3这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可能 具有差异(Armas etc，（2004) J? Clin ? Endocrinol .Metab ? 89:5387-5391 )，而传统的免疫方 法不能区分维生素D2和D3。现在越来越多的维生素D检测采用液相色谱串联质谱(LC-MS/ MS)的方法，该方面可以同时定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3,评估体内维生素D2 和D3的水平（Asuka Mochizukl，Yoshio Kodera, Tatsuya Saito , et al. Preanalytical evaluation of serum25-hydroxyvitamin D3and 25-hydroxyvitamin D2measurements using LC-MS/MS.Clinica Chimica Acta 420(2013)114-120)，并且方法专属性和灵敏度 性高。传统的25羟基维生素D检测方法有放射免疫法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等， 但是主要存在如下问题：第一、由于25-羟基维生素D在人体内主要与血清结合蛋白DBP结 合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存在严重的基质干扰。而传统的放射 免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰;第二，现有检测技术，前处理复杂、分析 时间长，方法特异性差;第三，不能同时准确定量25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含 量，无法给出准确的25-羟基维生素D的含量;第四，整个检测过程时间长、通量低。本发明对 25-羟基维生素D检测方法进行改良，前处理更加简单、方便，仅仅需要一步溶剂处理过程， 达到蛋白沉淀和样本萃取双重效果，时间大大缩短。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是解决现有25-羟基维生素D检测方法技术中存在的部分问题，提供 一种血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] -种血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：
[0006] (1)样本前处理:往离心管内加入内标溶液lOiil和人血清200iil，混合均匀，然后加 400-800yl丙酮，混合均匀，低温静置15-25分钟后置于离心机上，以13000rpm转速离心5分 钟；
[0007] 取上清液于第二离心管中，氮气吹干后加入200iil乙腈复溶，混合均匀后置于离心 机上，以13000rpm转速离心2-4分钟，取上清液；
[0008] (2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所 述色谱条件如下：
[0009] 色谱柱:4.6X30mm，3.5ym;
[0010] 初始流动相的流速lml/min，柱温30°C，检测时间6min，进样量50yl;
[0011]采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1;
[0012]表1为梯度洗脱参数
[0014] 所述流动相A为体积比0.05 %甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇；
[0015] 25-羟基维生素D3的保留时间为3.3min;
[0016] 25-羟基维生素D2的保留时间为3.5min;
[0017]所述多反应监测MRM质谱相关参数见表2，
[0018]表2为质谱参数
[0020]优选地，所述步骤(1)中低温为_20°C。
[0021 ]优选地，所述步骤(1)中混合均匀是在涡旋仪上混合40-60秒。
[0022]优选地，所述步骤(1)中第二离心管通过50°C氮气吹干。
[0023] 优选地，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用APCI离子源，检测离子对m/z分 别是：25-OHD2:413 ? 4-395 ? 2; 25-OHD3:401 ? 3-383 ? 6; d6-25-OHD3:407 ? 5-398 ? 5，离子源 位置为2;气帘气(⑶R)为30,碰撞气(CAD)为6,离子喷雾电压（IS)为5000V，温度为300°C，离 子源气流(GS1)为60。
[0024] 优选地，所述步骤(2)中初始甲酸水溶液与甲醇的体积比为20:80。
[0025]优选地，所述步骤（1)中丙酮为分析纯，含量为100%;乙腈为色谱纯，含量为 100%〇
[0026] 本发明的另一方面通过以下方案实现：
[0027] 血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测的试剂盒，所述试剂盒包括 如下溶液：
[0028] (1)洗脱液：
[0029] 洗脱液A:0.05%甲酸水溶液；
[0030] 洗脱液B:甲醇，纯度为100%;
[0031] (2)标准品母液:含25羟基维生素D2，25羟基维生素D3;
[0032] (3)内标溶液:含有d6-25羟基维生素D3的甲醇溶液；
[0033] (4)沉淀剂:丙酮，纯度为100%;
[0034] (5)复溶液：乙腈，纯度为100%;
[0035] (6)质控品：含有25羟基维生素D2，25羟基维生素D3的空白血清基质溶液，浓度分 别为QC1: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml;
[0036] (7)空白血清基质：小牛血清。
[0037]本发明的有益效果:通过对前处理方法的改良，前处理更加简单、快捷，可实现批 量处理；同时APCI为大气压力化学电离源，样品先形成雾，然后电晕放电针对其放电，在高 压电弧中，样品被电离，然后去溶剂化形成离子，最后检测，对极性小的样品效果较好，大大 提高了检测信号的灵敏度;方法学考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定 量分析要求;-20°C低温，低温静置可以让血清中的蛋白充分沉淀；柱温为30°C，接近于常 温，有利于被检测化合物的稳定，提高检测准确度。
【附图说明】
[0038]图1:25-羟基维生素D3、D2及内标的标准品总离子流色谱图；
[0039]图2:血清或血浆中25-羟基维生素D3、D2及内标的总离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0040] 为了更好地说明本发明，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述。
[0041] -种血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤： [0042] (1)样本前处理:往离心管内加入内标溶液10yl和人血清200iil，混合均匀，然后加 400-800yl丙酮，混合均匀，低温静置15-25分钟后置于离心机上，以13000rpm转速离心5分 钟；
[0043] 取上清液于第二离心管中，氮气吹干后加入200iil乙腈复溶，混合均匀后置于离心 机上，以13000rpm转速离心2-4分钟，取上清液；
[0044] (2)检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所 述色谱条件如下：
[0045] 色谱柱:4.6X30mm，3.5ym;
[0046] 初始流动相的流速lml/min，柱温30°C，检测时间6min，进样量为50yl;
[0047] 25-羟基维生素D3的保留时间为3.3min;
[0048] 25-羟基维生素D2的保留时间为3.5min;所述步骤（1)中低温为-20°C。所述步骤 (1)中混合均匀是在涡旋仪上混合40-60秒;所述步骤（1)中第二离心管通过50°C氮气吹干。 所述步骤(2)中甲酸水溶液与甲醇初始体积比为20:80。所述多反应监测MRM质谱相关参数 设置如下：
[0050]所述梯度洗脱的条件包括：
[0052] 所述流动相A为体积比0.05%甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇。所述质谱条件还包 括正离子模式下，采用APCI离子源，检测离子对(m/z)分别是：25-0^2:413.44395.2;25-OHD3:401 ? 3-383 ? 6; d6-25-OHD3:407 ? 5-398 ? 5，离子源位置为2;气帘气（CUR)为 30，碰撞 气(CAD)为6,离子喷雾电压（IS)为5000V，温度为300°C，离子源气流(GS1)为60。
[0053]血清或血浆中25-羟基维生素D液相色谱串联质谱检测的试剂盒，所述试剂盒包括 如下溶液：
[0054] (1)洗脱液：
[0055] 洗脱液A:0.05%甲酸水溶液；
[0056] 洗脱液B:甲醇，纯度为100%;
[0057] (2)标准品母液:含25羟基维生素D2，25羟基维生素D3;
[0058] (3)内标溶液:含有d6-25羟基维生素D3的甲醇溶液；
[0059] (4)沉淀剂:丙酮，纯度为100%;
[0060] (5)复溶液：乙腈，纯度为100%;
[00611 (6)质控品：含有25羟基维生素D2，25羟基维生素D3的空白血清基质溶液，浓度分 别为QC1: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml;
[0062] (7)空白血清基质：小牛血清；
[0063]所述试剂盒的组分如下表所示：
[0065] 具体实施例
[0066] 1、取1.5ml离心管，加入内标溶液10iU和人血清200yl，混合均匀(在涡旋仪上混合 45s)，然后加600iil丙酮，在涡旋仪上混合50s，于-20°C静置20min后，置于离心机上， 13000rpm，离心5min，取上清液于新的1.5ml离心管中，50°C氮气吹干。加入200yl乙腈复溶， 在祸旋仪上混合50s后，置于离心机上，13000rpm，离心3min，取上清，即得。
[0067] 2、检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式。
[0068] 其中色谱条件如下：
[0069]色谱柱：4.6X30mm，3.5ym
[0070] 初始流动相的流速lml/min，柱温30°C，检测时间6min，进样量为50yl。
[0071] 25-羟基维生素D3的保留时间为3.3min;
[0072] 25-羟基维生素D2的保留时间为3.5min;
[0073] 80%B_93%B梯度洗脱，洗脱条件见表1;
[0074]表1液相洗脱条件
[0076] 流动相A:体积比为0.05 %甲酸水溶液;流动相B:纯甲醇;所述甲酸水溶液与甲醇 初始体积比为20:80 [0077]质谱条件
[0078] 正离子模式下，采用APCI离子源，MRM检测方式检测，检测离子对(m/z)分别是:25_ 0HD2:413 ? 4-395 ? 2; 25-OHD3:401 ? 3-383 ? 6; d6-25-OHD3:407 ? 5-398 ? 5，离子源位置为 2。 气帘气(⑶R)为30,碰撞气(CAD)为6,离子喷雾电压（IS)为5000V，温度为300°C，离子源气流 (GS1)为60。聚焦电势(DP)、入口电势(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口（CXP)电势见表2。 [0079]表2质谱相关参数设置
[0081] 通过对前处理方法的改良，只需一步就可完成对25-羟基维生素D的萃取，前处理 更加简单、快捷，可实现批量处理。同时APCI离子源的应用，大大提高了检测信号的灵敏度。 液相色谱及质谱参数优化，定量更准确。
[0082]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护 范围为准。
【主权项】
1. 血清或血浆中25-?基维生素 D液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下 步骤： (1) 样本前处理:往离屯、管内加入内标溶液IOyl和人血清或血浆20化1，混合均匀，然后 加400-800iil丙酬，混合均匀，低溫静置15-25分钟后置于离屯、机上，W 130(K)rpm转速离屯、5 分钟； 取上清液于第二离屯、管中，氮气吹干后加入200iil乙腊复溶，混合均匀后置于离屯、机 上，W1300化pm转速离屯、2-4分钟，取上清液； (2) 检测方法为液相色谱串联质谱法，其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色 谱条件如下： 色谱柱:4.6 X 3Omm，3.5皿； 初始流动相的流速为Iml/min，柱溫30°C，检测时间为6min，进样量为50山； 采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1; 表1为梯度洗脱参数所述流动相A为体积比为0.05 %甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇； 25-径基维生素 D3的保留时间为3.3min; 25-径基维生素 D2的保留时间为3.5min; 所述多反应监测MRM质谱相关参数见表2， 亲2责席逆宏:狱O2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中低溫为-20°C。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中混合均匀是在满旋仪上混 合40-60秒。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中第二离屯、管通过50°C氮气 吹干。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用 APCI离子源，检测离子对m/z分别是：25-OHD2:413.4一395.2; 25-OHD3:401.3一383.6; d6- 25-OHD3:407.5一398.5，离子源位置为2;气帘气(CUR)为30，碰撞气(CAD)为6，离子喷雾电 压（IS)为5000V，溫度为300°C，离子源气流(GS1)为60。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中初始甲酸水溶液与甲醇的 体积比为20:80。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中丙酬为分析纯，含量为 100%;乙腊为色谱纯，含量为100 %。8. 血清或血浆中25-径基维生素 D液相色谱串联质谱检测的试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒包括如下溶液： (1) 洗脱液： 洗脱液A: 0.05 %甲酸水溶液； 洗脱液B:甲醇，纯度为100%; (2) 标准品母液:含25径基维生素 D2，25径基维生素 D3; (3) 内标溶液:含有(16-25?基维生素 D3的甲醇溶液； (4) 沉淀剂:丙酬，纯度为100 %; (5) 复溶液:乙腊，纯度为100%; (6) 质控品：含有25径基维生素02,25径基维生素 D3的空白血清基质溶液，浓度分别为 QCl:8ng/ml;QC2:20ng/ml;QC3:40ng/ml; (7) 空白血清基质:小牛血清。
【文档编号】G01N30/02GK105911160SQ201610220632
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】何健, 郭玉梅, 宋晓涛
【申请人】北京洛奇临床检验所股份有限公司