一种试剂盒、样品前处理方法和二硫氰基甲烷检测方法

一种试剂盒、样品前处理方法和二硫氰基甲烷检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种前处理试剂盒和分析系统，该前处理试剂盒中总计流管，接收控制器控制，当连通样品储存容器和可更换微型萃取柱，并断开至少一个密闭试剂容器和可更换微型萃取柱的连通时，将样品储存容器中的第一溶液注入到可更换微型萃取柱；当连通任意密闭试剂容器和可更换微型萃取柱，并断开样品储存容器和可更换微型萃取柱的连通时，将任意密闭试剂容器中的第二溶液注入到可更换微型萃取柱；可更换微型萃取柱当接收到第一溶液注入时，吸附第一溶液中的待检测成分，当接收到第二溶液注入时，脱附待检测成分；收集器收集脱附后的待检测成分和第二溶液。本发明提供的方案实现了对水体中低浓度二硫氰基甲烷的前处理。
【专利说明】
一种试剂盒、样品前处理方法和二硫氰基甲烷检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及分析技术领域，特别涉及一种试剂盒、样品前处理方法和二硫氰基甲 烷检测方法。
【背景技术】
[0002] 二硫氰基甲烷(分子结构式为NCS-CH2-SCN)是一种有机硫氰化合物，其对细菌、真 菌、藻类、霉菌、水体中原生动物和后生动物都有很好的杀灭作用和抑制作用，常常作为孔 雀石绿的替代药，通过全池泼洒和浸泡等方式应用于水产养殖过程杀菌。
[0003] 二硫氰基甲烷的加入，会使水产养殖过程中产生的养殖废水具有腐蚀性和毒害作 用，一旦养殖废水被直接排入江河湖泊中，将对人体健康和生态环境产生严重的危害，那么 对水体中二硫氰基甲烷的检测显得尤为重要。由于二硫氰基甲烷微溶于水，其在水中浓度 较低(通常为yg/l级以下），在对其进行检测之前常常需要进行前处理，目前，文献中尚无水 体中低浓度二硫氰基甲烷的前处理。

【发明内容】

[0004] 本发明实施例提供了一种试剂盒、样品前处理方法和二硫氰基甲烷检测方法，实 现了水体中低浓度二硫氰基甲烷的前处理。
[0005] -种试剂盒，包括:样品储存容器、至少一个密闭试剂容器、总计流管、控制器、可 更换微型萃取柱及收集器，其中，
[0006] 所述样品储存容器和所述至少一个密闭试剂容器分别通过各自对应的管线连接 到所述总计流管；
[0007]所述总计流管具有多阀门，一端连接所述管线，另一端连接所述可更换微型萃取 柱的顶端，用于接收到所述控制器控制，当所述多阀门连通所述样品储存容器和所述可更 换微型萃取柱，并断开所述至少一个密闭试剂容器和所述可更换微型萃取柱间的连通时， 将所述样品储存容器中的样品溶液注入到所述可更换微型萃取柱；当所述多阀门连通所述 至少一个密闭试剂容器中任意密闭试剂容器和所述可更换微型萃取柱，并断开所述样品储 存容器和所述可更换微型萃取柱间的连通时，将所述任意密闭试剂容器中的洗脱液注入到 所述可更换微型萃取柱；
[0008] 所述可更换微型萃取柱，用于当接收到所述样品溶液注入时，吸附所述样品溶液 中的待检测成分，当接收到所述洗脱液注入时，脱附所述待检测成分；
[0009] 所述收集器，用于收集所述可更换微型萃取柱脱附后的具有所述待检测成分的洗 脱液。
[0010] 优选地，所述收集器，包括:托盘、第一收集容器和第二收集容器，其中，
[0011] 所述托盘，用于放置所述第一收集容器和所述第二收集容器，当所述样品溶液注 入到所述可更换微型萃取柱时，接收所述控制器的调节，将所述第一收集容器调节到所述 可更换微型萃取柱下方；当所述洗脱液注入到所述可更换微型萃取柱时，接收所述控制器 的调节，将所述第二收集容器调节到所述可更换微型萃取柱下方；
[0012] 所述第一收集容器，当位于所述可更换微型萃取柱下方时，用于接收所述可更换 微型萃取柱流出的废液；
[0013] 所述第二收集容器，当位于所述可更换微型萃取柱下方时，用于接收所述可更换 微型萃取柱脱附后的所述待检测成分和洗脱液。
[0014] 优选地，所述至少一个密闭试剂容器，包括:第一密闭试剂容器、第二密闭试剂容 器和第三密闭试剂容器，其中，
[0015] 所述第一密闭试剂容器，用于盛装去离子水；
[0016] 所述第二密闭试剂容器，用于盛装甲醇；
[0017]所述第三密闭试剂容器，用于盛装洗脱液；
[0018]所述总计流管，用于接收所述控制器控制，通过所述多阀门连通所述第二密闭试 剂容器和所述可更换微型萃取柱，并控制所述第二密闭试剂容器中甲醇流速，向所述可更 换微型萃取柱中注入第一设定量甲醇;通过所述多阀门连通所述第一密闭试剂容器和所述 可更换微型萃取柱，并控制所述第一密闭试剂容器中去离子水流速，向所述可更换微型萃 取柱中注入第二设定量去离子水;通过所述多阀门连通所述第三密闭试剂容器和所述可更 换微型萃取柱，并控制所述第三密闭试剂容器中洗脱液流速，向所述可更换微型萃取柱中 注入第三设定量洗脱液；
[0019]所述可更换微型萃取柱，用于当分别接收所述第一设定量甲醇和第二设定量去离 子水时，活化;当接收所述第三设定量洗脱液时，通过所述洗脱液脱附所述待检测成分。
[0020] 优选地，所述待检测成分，包括:二硫氰基甲烷；
[0021] 所述洗脱液，包括：甲醇、乙腈及1:1的二氯甲烷和丙酮混合液中的任意一种。
[0022] -种利用上述任一所述的试剂盒实现的前处理方法，对样品溶液进行过滤，并将 过滤后的样品溶液加入到所述试剂盒中的样品储存容器中，将洗脱液加入到所述试剂盒中 的一个密闭试剂容器中，还包括：
[0023] 所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量的样品溶液注入；
[0024] 所述试剂盒中的可更换微型萃取柱吸附样品溶液中的待检测成分；
[0025] 所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第三设定量的洗脱液注入，脱附所述待检 测成分；
[0026] 通过所述试剂盒中的收集器收集脱附后的具有所述待检测成分的洗脱液。
[0027] 优选地，在所述对样品溶液进行过滤之前，进一步包括:通过乙酸将样品溶液pH调 节到4.0-6.0范围内；
[0028] 所述对样品溶液进行过滤，包括:通过孔径为0.45μπι的滤膜对pH范围为4.0-6.0的 样品溶液过滤。
[0029] 优选地，在通过所述试剂盒中的收集器收集脱附后的具有所述待检测成分的洗脱 液之后，进一步包括:通过氮吹方式浓缩所述待检测成分，并利用定容试剂对浓缩后的待检 测成分进行定容，所述定容试剂包括：甲醇和乙腈中的任意一种，优选乙腈。
[0030] 优选地，在所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量的样品溶液注入之 前，进一步包括:分别利用第一设定量甲醇和第二设定量去离子水活化所述试剂盒中的可 更换微型萃取柱；
[0031]所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入，包括:活化后 的可更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入。
[0032]优选地，上述方法进一步包括：
[0033] 控制所述样品溶液和所述洗脱液注入所述可更换微型萃取柱的流速，并控制所述 样品溶液注入所述可更换微型萃取柱第四设定量，控制所述洗脱液注入所述可更换微型萃 取柱第三设定量，其中，所述样品溶液，包括:具有二硫氰基甲烷的水溶液;所述洗脱液，包 括：甲醇、乙腈及1:1的二氯甲烷和丙酮混合液中的任意一种，优选乙腈。
[0034] -种基于上述任一所述的试剂盒实现的二硫氰基甲烷检测方法，包括：
[0035] 将试剂盒收集到的具有二硫氰基甲烷的洗脱液浓缩；
[0036] 利用定容溶剂将浓缩后的二硫氰基甲烷定容；
[0037] 获取5-10μ1定容溶液；
[0038]通过色谱检测5-10μ1定容溶液中二硫氰基甲烷浓度。
[0039]优选地，所述定容溶剂，包括：甲醇和乙腈中的任意一种，优选乙腈。
[0040] 优选地，所述色谱，包括:高效液相色谱；
[0041] 所述高效液相色谱检测二硫氰基甲烷浓度的条件设置，包括：
[0042] 吸收波长为254nm;
[0043] 流动相为30%乙腈-70%乙酸铵/乙酸；
[0044] 流动相流速为0.8ml/min。
[0045] 本发明实施例提供了一种试剂盒、样品前处理方法和二硫氰基甲烷检测方法，通 过试剂盒中的控制器控制可更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入，并吸附样品溶 液中的待检测成分，通过试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第三设定量洗脱液注入，脱附 待检测成分，通过试剂盒中的收集器收集脱附后的具有待检测成分的洗脱液，能够对待检 测成分进行富集，通过实验表明，当二硫氰基甲烷作为待检测成分，本发明实施例提供的试 剂盒能够对样品溶液如养殖水体中的二硫氰基甲烷进行富集，并通过洗脱液即可将吸附的 二硫氰基甲烷完全脱附，将低浓度的二硫氰基甲烷的富集为高浓度的二硫氰基甲烷，实现 了水体中二硫氰基甲烷的前处理。
【附图说明】
[0046] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 这些附图获得其他的附图。
[0047] 图1是本发明一个实施例提供的一种试剂盒的结构示意图；
[0048] 图2是本发明实施例提供的二硫氰基甲烷标准色谱图；
[0049] 图3是本发明实施例提供的经过试剂盒前处理后的养殖水样品中的二硫氰基甲烷 色谱图。
【具体实施方式】
[0050] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是 本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员 在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0051]如图1所示，本发明实施例提供一种试剂盒，该试剂盒包括:样品储存容器101、至 少一个密闭试剂容器102、总计流管103、控制器104、可更换微型萃取柱105及收集器106,其 中，
[0052] 样品储存容器101和至少一个密闭试剂容器102分别通过各自对应的管线连接到 总计流管103;
[0053]总计流管103具有多阀门1031，一端连接管线，另一端连接可更换微型萃取柱105 的顶端，用于接收控制器104控制，当多阀门1031连通样品储存容器101和可更换微型萃取 柱105,并断开至少一个密闭试剂容器102和可更换微型萃取柱105间的连通时，将样品储存 容器101中的样品溶液注入到可更换微型萃取柱105;当多阀门1031连通至少一个密闭试剂 容器102中任意密闭试剂容器和可更换微型萃取柱105,并断开样品储存容器101和可更换 微型萃取柱105间的连通时，将任意密闭试剂容器102中的洗脱液注入到可更换微型萃取柱 105；
[0054]可更换微型萃取柱105,用于当接收到样品溶液注入时，吸附样品溶液中的待检测 成分，当接收到洗脱液注入时，脱附待检测成分；
[0055] 收集器106,用于收集可更换微型萃取柱105脱附后的具有待检测成分的洗脱液。
[0056] 在图1所示的实施例中，通过试剂盒中的控制器可更换微型萃取柱接收第四设定 量样品溶液注入，并吸附样品溶液中的待检测成分，通过试剂盒中的可更换微型萃取柱接 收第三设定量洗脱液注入，脱附待检测成分，通过试剂盒中的收集器收集脱附后的具有待 检测成分的洗脱液，能够对待检测成分进行富集，通过实验表明，当二硫氰基甲烷作为待检 测成分，本发明实施例提供的试剂盒能够对样品溶液如养殖水体中的二硫氰基甲烷进行富 集，并通过洗脱液即可将吸附的二硫氰基甲烷完全脱附，将低浓度的二硫氰基甲烷的富集 为高浓度的二硫氰基甲烷，实现了水体中二硫氰基甲烷的前处理。
[0057]在将样品溶液注入到可更换微型萃取柱中时，可更换微型萃取柱吸附待检测成分 后的废液将排出可更换微型萃取柱，在本发明另一实施例中，为了实现对可更换微型萃取 柱排出的废液的收集，同时实现废液收集和洗脱液收集自动完成，上述试剂盒中收集器，包 括:托盘、第一收集容器和第二收集容器(图中未示出），其中，
[0058] 托盘，用于放置第一收集容器和第二收集容器，当样品溶液注入到可更换微型萃 取柱时，接收控制器的调节，将第一收集容器调节到可更换微型萃取柱下方；当洗脱液注入 到可更换微型萃取柱时，接收控制器的调节，将第二收集容器调节到可更换微型萃取柱下 方;该实施例中的托盘能够受控制器的调控，进行移动，当向可更换微型萃取柱中注入的是 样品溶液时，通过调节托盘，将第一接收器调节到可更换微型萃取柱下方，收集废液；当向 可更换微型萃取柱中注入的是洗脱液时，通过调节托盘，将第二接收器调节到可更换微型 萃取柱下方，具有待检测成分的洗脱液;BP :
[0059] 第一收集容器，当位于可更换微型萃取柱下方时，用于接收可更换微型萃取柱流 出的废液；
[0060] 第二收集容器，当位于可更换微型萃取柱下方时，用于接收可更换微型萃取柱脱 附后的待检测成分和洗脱液。
[0061] 在本发明又一实施例中，为了能够使可更换微型萃取柱吸附最大化，在可更换微 型萃取柱使用之前通过甲醇和去离子水对可更换微型萃取柱进行活化，同时利用少量的洗 脱液将可更换微型萃取柱中吸附的带检测成分完全脱附，上述至少一个密闭试剂容器102， 包括:第一密闭试剂容器、第二密闭试剂容器和第三密闭试剂容器，其中，
[0062] 第一密闭试剂容器，用于盛装去离子水；
[0063] 第二密闭试剂容器，用于盛装甲醇；
[0064] 第三密闭试剂容器，用于盛装洗脱液；
[0065] 通过将用于活化可更换微型萃取柱的去离子水和甲醇分别存储到第一密闭试剂 容器和第二密闭试剂容器，由于控制器能够控制第一密闭试剂容器和第二密闭容器与可更 换微型萃取柱相通，并控制第一设定量甲醇和第二设定量去离子水分别注入到可更换微型 萃取柱，实现了活化可更换微型萃取柱的自动化，即：
[0066] 总计流管103,用于接收控制器104控制，通过多阀门1031连通第二密闭试剂容器 和可更换微型萃取柱105,并控制第二密闭试剂容器中甲醇流速，向可更换微型萃取柱105 中注入第一设定量甲醇;通过多阀门1031连通第一密闭试剂容器和可更换微型萃取柱105， 并控制第一密闭试剂容器中去离子水流速，向可更换微型萃取柱105中注入第二设定量去 离子水;通过多阀门1031连通第三密闭试剂容器和可更换微型萃取柱105,并控制第三密闭 试剂容器中洗脱液流速，向可更换微型萃取柱中注入第三设定量洗脱液；
[0067] 可更换微型萃取柱105,用于当分别接收第一设定量甲醇和第二设定量去离子水 时，活化;当接收第三设定量洗脱液时，通过洗脱液脱附待检测成分。
[0068] 例如：可以控制甲醇、去离子水及洗脱液流速为5ml/min，可以控制甲醇的第一设 定量为5-8ml、去离子水的第二设定量为5-8ml及洗脱液的第三量为8ml。
[0069] 由于二硫氰基甲烷微溶于水，且在环境中二硫氰基甲烷不稳定，易分解，使得二硫 氰基甲烷在水体中的含量较低，而通过本发明实施例提供的试剂盒中的可更换微型萃取柱 能够实现对二硫氰基甲烷的富集，而为了能够收集完整试剂盒富集的二硫氰基甲烷，洗脱 液一般选择甲醇、乙腈及1:1的二氯甲烷和丙酮混合液中的任意一种，优选为乙腈。通过实 验结果表明，通过本发明实施例提供的试剂盒能够对设定量的水溶液(如l〇〇〇ml养殖水体） 中的二硫氰基甲烷实现完全吸附，而今需要8ml洗脱液即可完全将富集于可更换微型萃取 柱中的二硫氰基甲烷洗脱出来，实现了对二硫氰基甲烷的富集。该水溶液的量一般根据其 含有的二硫氰基甲烷而定，对于二硫氰基甲烷浓度较高的水体可以取500ml注入可更换微 型萃取柱，对于二硫氰基甲烷浓度较低的水体可以取1000ml、2000ml甚至更多注入可更换 微型萃取柱，以保证富集后的二硫氰基甲烷的浓度足够高，从而使后续检测的准确度更高。
[0070] 对于上述试剂盒来说，可以设计将试剂盒中的各个部分放入一个壳体内，通过在 壳体中为样品储存容器101、至少一个密闭试剂容器102设置一定的区域，由于控制器104的 存在，其能够施加一定的动力使样品储存容器101、至少一个密闭试剂容器102中的溶液注 入到可更换微型萃取柱105中，还可为每一个管线设置一个蠕动栗，通过控制器控制蠕动栗 来实现将样品储存容器101、至少一个密闭试剂容器102中的溶液注入到可更换微型萃取柱 中。其中，样品储存容器101和至少一个密闭试剂容器102在壳体中的位置可以灵活设置，其 可设置于壳体顶部，位于总计流管103之上，遵循液体从高向低出流动的原理，减少控制器 控制样品储存容器101和至少一个密闭试剂容器102中的溶液注入到可更换微型萃取柱105 的过程中所消耗的能量。
[0071] 本发明一个实施例提供一种利用上述任意一种试剂盒实现的前处理方法，该前处 理方法包括步骤如下：
[0072] A1、对样品溶液进行过滤，并将过滤后的样品溶液加入到试剂盒中的样品储存容 器中，将洗脱液加入到试剂盒中的一个密闭试剂容器中；
[0073] 该步骤是为了去除样品溶液中大颗粒物质，从而避免样品溶液中大颗粒物质对可 更换微型萃取柱的污染，另外，将过滤后的样品溶液加入到试剂盒中的样品储存容器中，将 洗脱液加入到试剂盒中的一个密闭试剂容器中是进行前处理之前的准备工作，通过将洗脱 液加入到密闭试剂容器中可以避免洗脱液的挥发，从而使洗脱液能够较长时间的保存，而 无需每次进行前处理时重新加入洗脱液。
[0074] A2、试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入；
[0075] 在该步骤中，优选地通过试剂盒中的控制器控制样品储存容器中的样品溶液注入 到可更换微型萃取柱中的流速为5ml/min，该样品溶液的量一般根据其含有的二硫氰基甲 烷而定，对于二硫氰基甲烷浓度较高的水体可以取500ml注入可更换微型萃取柱，对于二硫 氰基甲烷浓度较低的水体可以取1000ml、2000ml甚至更多注入可更换微型萃取柱，以保证 富集后的^硫氛基甲烧的浓度足够尚，从而使后续检测的准确度更尚。
[0076] A3、试剂盒中的可更换微型萃取柱吸附样品溶液中的待检测成分；
[0077] A4、试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第三设定量洗脱液注入，脱附待检测成分；
[0078] 在该步骤中，优选地，通过试剂盒中的控制器控制密闭试剂容器中的洗脱液注入 到可更换微型萃取柱中的流速为5ml/min，洗脱液液注入量为8ml，洗脱液，包括：甲醇、乙腈 及1:1的二氯甲烷和丙酮混合液中的任意一种，更优选乙腈。
[0079] A5、通过试剂盒中的收集器收集脱附后的具有待检测成分的洗脱液。
[0080] 由于洗脱液用量远远低于样品溶液的量，同时，洗脱液能够将可更换微型萃取柱 吸附的样品溶液中的待检测成分完全洗脱下来，使得该A5中得到的具有待检测成分的洗脱 液中的待检测成分的浓度，相比于样品溶液中待检测成分的浓度有很大的提高，而浓度的 提尚将有利于后续检测的准确性。
[0081] 由于二硫氰基甲烷在环境中容易分解，为了保证二硫氰基甲烷的稳定性，通过在 不同pH条件下检测二硫氰基甲烷回收率的实验确定具有二硫氰基甲烷的样品溶液的pH，本 实验检测了样品溶液在酸性(pH为5)、中性(pH为7)和碱性(pH为9)条件下二硫氰基甲烷的 回收率。实验结果显示表明，随着pH的降低，二硫氰基甲烷的回收率越来越高，而在强酸性 条件下可对试剂盒中的可更换微型萃取柱产生影响，因此，在本发明另一实施例中，在A1之 前进一步包括:通过乙酸将样品溶液pH调节到4.0-6.0范围内，优选地，将样品溶液pH调节 到5.0左右。
[0082] 为了保证将样品溶液中的大颗粒物质完全滤出，防止大颗粒物质赌塞试剂盒中的 可替换可更换微型萃取柱，在本发明另一实施例中，A1中的对样品溶液进行过滤的具体实 施方式，包括:通过孔径为〇. 45μπι的滤膜对pH范围为4.0-6.0的样品溶液过滤。
[0083]为了能够进一步对待检测成分进行浓缩，同时保证后续检测的准确性，在A5之后， 进一步包括:通过氮吹方式浓缩待检测成分，并利用定容试剂对浓缩后的待检测成分进行 定容，定容试剂包括：甲醇和乙腈中的任意一种，优选乙腈；由于洗脱液一般为有机溶剂，其 挥发性比较强，该氮吹方式是将氮气吹到具有待检测成分的洗脱液表面，由于氮气具有较 好的稳定性，其不与洗脱液发生化学反应，增加了洗脱液表面的空气流通，从而使洗脱液快 速的挥发，大大缩短了浓缩时间。通过对浓缩后的待检测成分进行定容，可以通过后续检测 出待检测成分的浓度准确的计算出浓缩后的待检测成分的质量，从而推算出样品溶液中待 检测成分的含量。
[0084] 为了能够使试剂盒中可更换微型萃取柱的吸附最大化，在A2之前，进一步包括:分 别利用第一设定量如5_8ml甲醇和第二设定量如5-8ml去离子水活化试剂盒中的可更换微 型萃取柱;通过该甲醇和去离子水实现对可更换微型萃取柱的活化。A2的【具体实施方式】包 括:活化后的可更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入。
[0085] 以水体中包含的待检测成分是二硫氰基甲烷为例，展开说明通过本发明实施例提 供的试剂盒实现的前处理方法，该前处理方法可以包括如下步骤：
[0086] B1、通过乙酸将具有二硫氰基甲烷的水溶液pH调节到4.0-6.0范围内；
[0087]从待检水体中取设定量的水样作为本实施例的水溶液，通过检测不同pH的二硫氰 基甲烷的水溶液中二硫氰基甲烷的回收率发现，随着pH的降低，二硫氰基甲烷的回收率越 来越高，而在强酸性条件下可对试剂盒中的可更换微型萃取柱产生影响，该步骤中以乙酸 溶液调节水溶液的pH，乙酸作为有机弱酸，其能够比较快速的将水溶液pH调节到4.0-6.0范 围内，优选pH为5.0左右，而不会使水溶液体积变化太大。另外，在弱酸性条件下，也能够使 水溶液中的其他杂质沉淀出来，从而在下述B2中将杂质去除，减少杂质对试剂盒中的可更 换微型萃取柱的污染。
[0088] B2、通过孔径为0.45μπι的滤膜对pH范围为4.0-6.0的具有二硫氰基甲烷的水溶液 过滤；
[0089] 在该步骤中，通过0.45μπι的滤膜，能够将水溶液中的大颗粒物质去除，例如:对于 养殖水体来说，其除了一些脂类有机物、二硫氰基甲烷等有机物之外，还存在大颗粒的腐殖 质类物质，那么，当水溶液为养殖水样品时，通过该步骤能够将养殖水样品中腐殖质类的物 质去掉。
[0090] Β3、将过滤后的水溶液加入到试剂盒中的样品储存容器中，将洗脱液加入到试剂 盒中的一个密闭试剂容器中；
[0091 ]将过滤后的水溶液加入到试剂盒中的样品储存容器中，将洗脱液加入到试剂盒中 的一个密闭试剂容器中是进行前处理之前的准备工作，通过将洗脱液加入到密闭试剂容器 中可以避免洗脱液的挥发，从而使洗脱液能够较长时间的保存，而无需每次进行前处理时 重新加入洗脱液。
[0092]值得说明的是，为了进一步去除养殖水样品中的除二硫氰基甲烷之外的其他有机 物，还可在将养殖水样品加入样品储存容器之前，将养殖水样品过各种类型的萃取柱，从而 将酯类等有机物去除，另外，还可以在试剂盒中设置多个各种类型的萃取柱，将各种类型的 萃取柱串联，在将水溶液注入可替换可更换微型萃取柱之前，将水溶液依次流过各个串联 的各种类型的萃取柱，该过程也实现了去除除二硫氰基甲烷之外的其他有机物，从而降低 了水溶液中的其他有机物对二硫氰基甲烷回收率的影响。
[0093] Β4、分别利用5-8ml的甲醇和去离子水活化试剂盒中的可更换微型萃取柱；
[0094] 通过甲醇和去离子水对试剂盒中的可更换微型萃取柱活化，能够使试剂盒中的可 更换微型萃取柱对水溶液中的二硫氰基甲烷具有较好的吸附性，同时通过选择乙腈作为洗 脱液能够尽可能完整的将可更换微型萃取柱吸附的二硫氰基甲烷脱附，从而保障了对水溶 液中二硫氰基甲烷富集的完整性。
[0095] B5、试剂盒中活化后的可更换微型萃取柱接收设定量水溶液注入，注入流速为 5ml/min；
[0096] 该步骤设定的流速为5ml/min，使流经可更换微型萃取柱后的废液一滴一滴的滴 入废液收集容器中，保证水溶液能够全面的与可更换微型萃取柱中的吸附材料接触，从而 使得水溶液中的二硫氰基甲烷能够尽可能完全的被吸附在可更换微型萃取柱中。为了能够 更优的选择可更换微型萃取柱的类型，本发明实施例通过实验对比了Oasis HLB固相萃取 柱、Oasis MCX固相萃取柱和DSC-18固相萃取柱对于水溶液中二硫氰基甲烷的回收率的影 响，结果表明，Oasis MCX固相萃取柱和C-18固相萃取柱萃取回收率较低，Oasis HLB固相萃 取柱对二硫氰基甲烷的回收率在85%以上，因此，在该步骤中，优选地，以Oasis HLB固相萃 取柱作为可更换微型萃取柱。该水溶液的量与水溶液中二硫氰基甲烷的含量相关，通过实 验表明，在该步骤中可以接收1 〇〇〇ml养殖水样品的注入。
[0097] B6、试剂盒中的可更换微型萃取柱吸附水溶液中的二硫氰基甲烷；
[0098]当B5选择Oasis HLB固相萃取柱作为可更换微型萃取柱时，水溶液以流动相的方 式流经Oasis HLB固相萃取柱过程中，Oasis HLB固相萃取柱吸附水溶液中的二硫氰基甲 烷，同时将吸附二硫氰基甲烷后的水溶液即废液排出。
[0099] B7、试剂盒中的可更换微型萃取柱接收8ml的洗脱液注入，脱附待检测成分，洗脱 液的注入流速为5ml/min;
[0100] 将吸附的设定量水溶液中的二硫氰基甲烷通过8ml洗脱液进行洗脱，实现对二硫 氰基甲烷的回收，同时大大增加了二硫氰基甲烷的浓度，有利于二硫氰基甲烷检测的准确 性。通过洗脱液的注入流速为5ml/min，可以使洗脱液能够完全与可更换微型萃取柱中的吸 附材料接触，从而使二硫氰基甲烷的回收率在合理范围内。另外，通过检测不同流速对二硫 氰基甲烷的回收率的影响表明，随着流速的降低，二硫氰基甲烷回收率升高，当流速降低到 5ml/min以下时，二硫氰基甲烷回收率变化不明显且用时大大增加，因此，在该步骤中，控制 洗脱液的注入流速为5ml/min。
[0101] -般来说，常见的洗脱液包括：甲醇、乙腈及1:1的二氯甲烷和丙酮混合液中的任 意一种，在本发明实施例中，检测上述三种洗脱液对二硫氰基甲烷回收率的影响，结果表 明，甲醇、乙腈、1:1二氯甲烷和丙酮混合液分别对可更换微型萃取柱进行洗脱，洗脱后对应 的二硫氰基甲烷的回收率分别为72.8 %和85.2 %、69.1 %，因此，该步骤中，优选乙腈作为 二硫氰基甲烷的洗脱液。
[0102] B8、通过试剂盒中的收集器收集脱附后的具有待检测成分的洗脱液。
[0103] 由于洗脱液用量远远低于样品溶液的量，同时，洗脱液能够将可更换微型萃取柱 吸附的样品溶液中的待检测成分完全洗脱下来，使得该B8中得到的具有待检测成分的洗脱 液中的待检测成分的浓度，相比于水溶液中待检测成分的浓度有很大的提高，而浓度的提 尚将有利于后续检测的准确性。
[0104] B9、通过氮吹方式浓缩洗脱液中的待检测成分；
[0105] 上述B8回收后的二硫氰基甲烷溶于8ml洗脱液中，为了能够进一步对8ml洗脱液中 的二硫氰基甲烷进行浓缩，且更换为与流动相一致的定容液。该步骤中通过氮吹方式去除 洗脱液，由于洗脱液一般为有机溶剂，其挥发性比较强，该氮吹方式是将氮气吹到具有待检 测成分的洗脱液表面，由于氮气具有较好的稳定性，其不与洗脱液发生化学反应，增加了洗 脱液表面的空气流通，从而使洗脱液快速的挥发，大大缩短了浓缩时间。
[0106] 另外，由于以色谱对二硫氰基甲烷进行检测过程中，常以甲醇或乙腈作为流动相， 那么，当洗脱液为1:1二氯甲烷和丙酮混合液时，在该步骤中，需要将1:1二氯甲烷和丙酮混 合液完全挥发，只剩下二硫氰基甲烷，并转溶剂为甲醇或者乙腈，通过下述B10对二硫氰基 甲烷进行定容；当洗脱液为甲醇或者乙腈时，在该步骤中，可将收集器中收集的溶液蒸发到 剩余lml，从而可以省略下述B10的过程，当蒸发后，收集器中的溶液小于lml时，可通过下述 B10将溶液定容到lml。
[0107] B10、利用定容试剂对浓缩后的待检测成分进行定容，定容试剂包括：甲醇和乙腈 中的任意一种，优选乙腈；
[0108] 由于甲醇挥发性大于乙腈，而溶剂大量的挥发，将影响二硫氰基甲烷浓度检测的 准确性，因此，在该步骤中，定容优选乙腈作为定容试剂。
[0109] 由于试剂盒浓缩后的二硫氰基甲烷浓度高，那么，通过将浓缩后高浓度的二硫氰 基甲烷的检测结果换算为实际样品中的二硫氰基甲烷的浓度，便可知实际样品中低浓度二 硫氰基甲烷的浓度，从而实现测定水体中的二硫氰基甲烷。
[0110] 本发明一个实施例提供一种基于上述任一所述的试剂盒实现的二硫氰基甲烷检 测方法，该检测方法包括可以包括如下步骤：
[0111] C1、将试剂盒收集到的具有二硫氰基甲烷的洗脱液浓缩；
[0112] 该步骤提出的浓缩过程是为了进一步提高二硫氰基甲烷的浓度，从而提高二硫氰 基甲烷检测的灵敏度和准确性。该步骤的浓缩过程可以通过旋转蒸发的方式浓缩，还可以 通过氮吹的方式将洗脱液挥发实现浓缩，由于旋转蒸发针对大容积量比较方便，在该步骤 中，优选地氮吹的方式进行浓缩。
[0113] C2、利用定容溶剂将浓缩后的二硫氰基甲烷定容；
[0114] 通过该步骤定容，可以准确的推算出水溶液中二硫氰基甲烷的含量，
[0115] 水溶液中二硫氰基甲烷的浓度可以通过下述公式(1)进行计算：
(1)
[0117] 其中，Θ表征水溶液中二硫氰基甲烷的浓度;Vi表征浓缩定容体积;V2表征水溶液的 体积；当定容体积Vi = lml;水溶液体积V2 = 1000ml，推算得
，即通过定容到lml，对 1000ml水溶液(如养殖水样品）中的二硫氰基甲烷进行浓缩能够有效地简化计算过程。
[0118] C3、获取5-10μ1定容溶液；
[0119] 在本发明实施例中以色谱检测二硫氰基甲烷的浓度，而色谱的量程在25μ1以下， 即当该步骤中获取的定容溶液超过25μ1时，色谱无法准确检测二硫氰基甲烷的浓度。通过 5-1 ΟμL定容溶液能够使色谱的出峰位置较佳，优选地，1 ΟμL定容溶液使色谱出峰位置最佳。
[0120] C4、通过色谱检测5-10μ1定容溶液中二硫氰基甲烷浓度。
[0121] 在该检测过程中需要对色谱中的各个参数如流动相、吸收波长、流动相流速等进 行设置，而这些参数将直接影响检测二硫氰基甲烷的灵敏度。
[0122] 在本发明一个实施例中，上述定容溶剂，包括：甲醇和乙腈中的任意一种，优选乙 腈。甲醇和乙腈是色谱中常用的溶剂，但由于甲醇挥发性较高，常常造成检测结果偏高，因 此，本发明实施例优选乙腈作为定容溶剂。
[0123] 在本发明一个实施例中，色谱，包括:高效液相色谱；
[0124] 高效液相色谱检测二硫氰基甲烷浓度的条件设置，包括：
[0125] 吸收波长为254nm;流动相为30 %乙腈-70 %乙酸铵/乙酸；流动相流速为0.8ml/ min〇
[0126] 通过对二硫氰基甲烷进行全波长扫描发现，其在254nm处有最大吸收，因此，本发 明实施例确定高效液相色谱的检测波长为254nm。
[0127] 在高效液相色谱中，主要通过对特征吸收峰处积面积，并将特征吸收峰处积的面 积转化为对应的浓度，而出峰的峰形越窄，没有拖尾，对峰积出的峰面积转化为对应的浓度 的准确性越高，而峰面积转化为浓度的过程常常通过标准曲线来完成。下面将通过实验摸 索高效液相色谱检测二硫氰基甲烷浓度的条件的优化设置，以优化出峰峰形，另外通过配 置一系列标准样品来做二硫氰基甲烷的标准曲线。
[0128] 高效液相色谱检测二硫氰基甲烷浓度的条件优化过程：
[0129] 通过选择乙腈-乙酸铵/氨水(pH为9)、乙腈-水和乙腈-乙酸胺/乙酸(pH为5)分别 作流动相进行比较实验，结果表明，当采用乙腈-水和乙腈-乙酸铵/氨水作为流动相时，二 硫氰基甲烷的峰形较宽，后拖尾严重；当选用乙腈-乙酸胺/乙酸作为流动相，峰形得到了很 好的改善，因此，本发明实施例选择乙腈-乙酸胺/乙酸作为流动相。
[0130] 通过将缓冲溶液pH分别调至5、7、9进行优化。当缓冲液pH = 7和9时，高效液相色谱 对二硫氰基甲烷灵敏度不高，只有当pH为5时，峰形最好，灵敏度最高。
[0131]比较了乙腈-水和乙腈-乙酸胺/乙酸(pH为5)的比例为30:70和50:50两种流动相， 30:70的流动相不仅峰形好，而且灵敏度也高，重复性也好。
[0132] 通过上述高效液相参数设置(吸收波长为254nm;流动相为30%乙腈-70%乙酸铵/ 乙酸;流动相流速为〇.8ml/min)形成的二硫氰基甲烷的标准色谱图（如图2所示）和经过试 剂盒前处理后的养殖水样品中的二硫氰基甲烷色谱图（如图3所示），在流动相流速为 0.8ml/min时，二硫氰基甲烧的出峰位置在9-10min。
[0133] 标准曲线的制作过程:称取二硫氰基甲烷0.0050g，溶于50ml乙腈中，作为储备液。 后用乙腈-乙酸胺/乙酸作溶剂进行稀释，分别至lmg/1、2mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l。采用 上述色谱条件（吸收波长为254nm;流动相为30 %乙腈-70 %乙酸铵/乙酸；流动相流速为 0.8ml/min)，进样10μ1。以二硫氰基甲烷的浓度及所得到的相应峰面积做定量校准曲线，得 到线性方程Υ = 4874.7Χ-1823.3，相关系数0.9971。另外，通过将高、中、低三个浓度的二硫 氰基甲烷标准溶液，采用上述色谱条件（吸收波长为254nm;流动相为30%乙腈-70%乙酸 铵/乙酸;流动相流速为0.8ml/min)，每组平行做7次。计算其相对标准偏差<9.15%以内， 表明本发明实施例提供的该种测试方法能够比较准确的测定出水溶液中二硫氰基甲烷的 浓度。
[0134] 值得说明的是，在本发明中所提及的可更换微型萃取柱中吸附材料的量一般以mg 来计量如具有60mg吸附材料的Oasis HLB固相萃取柱等。另外，在本发明中提及的二硫氰基 甲烷回收率主要是指通过本发明实施例提供的试剂盒从样品溶液中回收二硫氰基甲烷的 量占样品溶液中二硫氰基甲烷的百分比，那么，回收率越高，在后续检测过程中，检测结果 也就越能表征样品溶液中^?硫氛基甲烧的含量。
[0135] 根据上述方案，本发明的各实施例，至少具有如下有益效果：
[0136] 1.通过试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入，并吸附样品 溶液中的待检测成分，通过试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第三设定量洗脱液注入，脱 附待检测成分，通过试剂盒中的收集器收集脱附后的具有待检测成分的洗脱液，能够对待 检测成分进行富集，通过实验表明，当二硫氰基甲烷作为待检测成分，本发明实施例提供的 试剂盒能够对样品溶液如养殖水体中的二硫氰基甲烷进行富集，并通过洗脱液即可将吸附 的二硫氰基甲烷完全脱附，将低浓度的二硫氰基甲烷的富集为高浓度的二硫氰基甲烷，实 现了水体中二硫氰基甲烷的前处理。
[0137] 2.由于试剂盒浓缩后的二硫氰基甲烷浓度高，那么，通过将浓缩后高浓度的二硫 氰基甲烷的检测结果换算为实际样品中的二硫氰基甲烷的浓度，便可知实际样品中低浓度 二硫氰基甲烷的浓度，从而实现测定水体中的二硫氰基甲烷。
[0138] 3.在试剂盒中通过控制器调节总计流管中的多阀门，使样品储存容器和至少一个 密闭试剂容器能够分别与可更换微型萃取柱相通，并且每次仅有一个容器与可更换微型萃 取柱相通，使得样品溶液和洗脱液能够自动的注入到可更换微型萃取柱中，而无须人工的 参与，因此，本发明实施例提供的试剂盒实现了自动化。
[0139] 4.通过本发明实施例提供的的试剂盒和前处理方法能够较完整的对样品溶液中 二硫氰基甲烷进行富集，而通过本发明提供的高效液相色谱检测方法和检测条件，对于二 硫氰基甲烷灵敏度高、准确度好，能够有效地提高了低浓度二硫氰基甲烷的检测准确性。 [0140]需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体 或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在 任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非 排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素， 而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固 有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句"包括一个......"限定的要素，并不排 除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
[0141]本发明中所提供的各个实施例均可根据需要而相互组合，例如任意两个、三个或 更多个实施例中的特征相互组合以构成本发明的新的实施例，这也在本发明的保护范围 内，除非另行说明或者在技术上构成矛盾而无法实施。
[0142]最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技 术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、 等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种试剂盒，其特征在于，包括:样品储存容器、至少一个密闭试剂容器、总计流管、 控制器、可更换微型萃取柱及收集器，其中， 所述样品储存容器和所述至少一个密闭试剂容器分别通过各自对应的管线连接到所 述总计流管； 所述总计流管具有多阀门，一端连接所述管线，另一端连接所述可更换微型萃取柱的 顶端，用于接收所述控制器控制，当所述多阀门连通所述样品储存容器和所述可更换微型 萃取柱，并断开所述至少一个密闭试剂容器和所述可更换微型萃取柱间的连通时，将所述 样品储存容器中的样品溶液注入到所述可更换微型萃取柱；当所述多阀门连通所述至少一 个密闭试剂容器中任意密闭试剂容器和所述可更换微型萃取柱，并断开所述样品储存容器 和所述可更换微型萃取柱间的连通时，将所述任意密闭试剂容器中的洗脱液注入到所述可 更换微型萃取柱； 所述可更换微型萃取柱，用于当接收到所述样品溶液注入时，吸附所述样品溶液中的 待检测成分，当接收到所述洗脱液注入时，脱附所述待检测成分； 所述收集器，用于收集所述可更换微型萃取柱脱附后的具有所述待检测成分的洗脱 液。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述收集器，包括:托盘、第一收集容器 和第二收集容器，其中， 所述托盘，用于放置所述第一收集容器和所述第二收集容器，当所述样品溶液注入到 所述可更换微型萃取柱时，接收所述控制器的调节，将所述第一收集容器调节到所述可更 换微型萃取柱下方；当所述洗脱液注入到所述可更换微型萃取柱时，接收所述控制器的调 节，将所述第二收集容器调节到所述可更换微型萃取柱下方； 所述第一收集容器，当位于所述可更换微型萃取柱下方时，用于接收所述可更换微型 萃取柱流出的废液； 所述第二收集容器，当位于所述可更换微型萃取柱下方时，用于接收所述可更换微型 萃取柱脱附后的所述待检测成分和洗脱液。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述至少一个密闭试剂容器，包括:第一 密闭试剂容器、第二密闭试剂容器和第三密闭试剂容器，其中， 所述第一密闭试剂容器，用于盛装去离子水； 所述第二密闭试剂容器，用于盛装甲醇； 所述第三密闭试剂容器，用于盛装洗脱液； 所述总计流管，用于接收所述控制器控制，通过所述多阀门连通所述第二密闭试剂容 器和所述可更换微型萃取柱，并控制所述第二密闭试剂容器中甲醇流速，向所述可更换微 型萃取柱中注入第一设定量甲醇;通过所述多阀门连通所述第一密闭试剂容器和所述可更 换微型萃取柱，并控制所述第一密闭试剂容器中去离子水流速，向所述可更换微型萃取柱 中注入第二设定量去离子水;通过所述多阀门连通所述第三密闭试剂容器和所述可更换微 型萃取柱，并控制所述第三密闭试剂容器中洗脱液流速，向所述可更换微型萃取柱中注入 第三设定量洗脱液； 所述可更换微型萃取柱，用于当分别接收所述第一设定量甲醇和第二设定量去离子水 时，活化;当接收所述第三设定量洗脱液时，通过所述洗脱液脱附所述待检测成分。4. 根据权利要求1至3任一所述的试剂盒，其特征在于， 所述待检测成分，包括:二硫氰基甲烷； 所述洗脱液，包括：甲醇、乙腈及1:1的二氯甲烷和丙酮混合液中的任意一种。5. -种利用权利要求1至4任一所述的试剂盒实现的前处理方法，其特征在于，对样品 溶液进行过滤，并将过滤后的样品溶液加入到所述试剂盒中的样品储存容器中，将洗脱液 加入到所述试剂盒中的一个密闭试剂容器中，还包括： 所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量的样品溶液注入； 所述试剂盒中的可更换微型萃取柱吸附样品溶液中的待检测成分； 所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第三设定量的洗脱液注入，脱附所述待检测成 分； 通过所述试剂盒中的收集器收集脱附后的具有所述待检测成分的洗脱液。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于， 在所述对样品溶液进行过滤之前，进一步包括:通过乙酸将样品溶液pH调节到4.0-6.0 范围内； 所述对样品溶液进行过滤，包括:通过孔径为〇. 45μηι的滤膜对pH范围为4.0-6.0的样品 溶液过滤； 和/或， 在通过所述试剂盒中的收集器收集脱附后的具有所述待检测成分的洗脱液之后，进一 步包括:通过氮吹方式浓缩所述待检测成分，并利用定容试剂对浓缩后的待检测成分进行 定容，所述定容试剂包括：甲醇和乙腈中的任意一种； 和/或， 在所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量的样品溶液注入之前，进一步包 括:分别利用第一设定量甲醇和第二设定量去离子水活化所述试剂盒中的可更换微型萃取 柱； 所述试剂盒中的可更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入，包括:活化后的可 更换微型萃取柱接收第四设定量样品溶液注入。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，进一步包括： 控制所述样品溶液和所述洗脱液注入所述可更换微型萃取柱的流速，并控制所述样品 溶液注入所述可更换微型萃取柱第四设定量，控制所述洗脱液注入所述可更换微型萃取柱 第三设定量，其中，所述样品溶液，包括:具有二硫氰基甲烷的水溶液;所述洗脱液，包括：甲 醇、乙腈及1:1的二氯甲烷和丙酮混合液中的任意一种。8. -种基于权利要求1至4任一所述的试剂盒实现的二硫氰基甲烷检测方法，其特征在 于，包括： 将试剂盒收集到的具有二硫氰基甲烷的洗脱液浓缩； 利用定容溶剂将浓缩后的二硫氰基甲烷定容； 获取5-10μ1定容溶液； 通过色谱检测5-10μ1定容溶液中二硫氰基甲烷浓度。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于， 所述定容溶剂，包括：甲醇和乙腈中的任意一种。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述色谱，包括:高效液相色谱； 所述高效液相色谱检测二硫氰基甲烷浓度的条件设置，包括： 吸收波长为254nm; 流动相为30 %乙腈-70 %乙酸铵/乙酸； 流动相流速为〇.8ml/min。
【文档编号】G01N30/74GK106018636SQ201610507287
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】杨秋红, 艾晓辉, 刘永涛, 胥宁, 董靖, 杨移斌
【申请人】中国水产科学研究院长江水产研究所